p53、MDM2和PCNA在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

李小靜，李柳君，張秀娟，李志鋒

（1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，河北邯鄲056002；2.河北省永年縣第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北邯鄲057150）

p53、MDM2和PCNA在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

李小靜1，李柳君2，張秀娟1，李志鋒1

（1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，河北邯鄲056002；2.河北省永年縣第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北邯鄲057150）

目的探討p53、鼠雙微體2（murine double mimute 2，MDM2）和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮損中的表達(dá)及意義。方法選擇皮膚鱗狀細(xì)胞癌30例，正常皮膚組織15例，分別采用免疫組織化學(xué)法檢測皮損中p53、MDM2和PCNA蛋白的表達(dá)。結(jié)果皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中p53、MDM2、PCNA蛋白的陽性表達(dá)均明顯高于正常皮膚組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.697、19.397、5.625，P＜0.05）。結(jié)論p53、MDM2的高表達(dá)提示其在皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

皮膚腫瘤；基因，p53；原癌基因蛋白質(zhì)c-mdm2；增殖細(xì)胞核抗原

作為腫瘤抑癌基因，p53在細(xì)胞內(nèi)的中心作用是介導(dǎo)DNA損傷后的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，避免受損后的DNA堆積，維持基因的穩(wěn)定性。鼠雙微體2（murine double mimute 2，MDM2）作為p53基因轉(zhuǎn)錄激活的產(chǎn)物可以抑制p53的活性。皮膚鱗狀細(xì)胞癌（簡稱皮膚鱗癌）作為常見的皮膚惡性腫瘤，其細(xì)胞惡性增殖可能涉及由MDM2維持的p53自身平衡機(jī)制的失衡。為了進(jìn)一步探討皮膚鱗癌中p53、MDM2的表達(dá)情況及其與腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)系，我們選擇皮膚鱗癌及正常皮膚組織，分別采用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察皮損中p53、MDM2和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）蛋白的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2009年1月—2011年5月河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)常規(guī)組織病理確診的皮膚鱗癌患者30例，男性16例，女性14例，年齡34～87歲，平均62.8歲，病程1個(gè)月～30年，平均3.48年。其中頭面部12例，背部1例，手部6例，四肢9例，外陰部位2例；暴露部位（頭面部及手）18例（60%），非暴露部位12例（40%）。正常皮膚組織15例，男性10例（正常人包皮手術(shù)切除標(biāo)本），女性5例（鱗癌周邊正常組織），年齡20～75歲，平均58.5歲。

1.2 主要試劑：鼠抗人p53單克隆抗體、鼠抗人MDM2單克隆抗體及鼠抗人PCNA單克隆抗體購自北京中山生物技術(shù)有限公司。即用型快速免疫組織化學(xué)MaxVisionTM檢測試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺顯色劑均購于福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 p53、MDM2和PCNA檢測：采用免疫組織化學(xué)MaxVisionTM法檢測p53、MDM2和PCNA的表達(dá)。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，微波檸檬酸抗原修復(fù)，滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜，滴加二抗，濕盒內(nèi)37℃孵育15min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明后封片，光鏡下觀察結(jié)果。PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，以已知陽性片作陽性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定：連續(xù)觀察5～10個(gè)含表皮的高倍鏡視野，觀察每個(gè)視野p53、MDM2陽性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞染色陽性率以半定量4個(gè)等級(jí)表示。陰性（-），p53、MDM2陽性細(xì)胞數(shù)＜10%；弱陽性（+），p53、MDM2陽性細(xì)胞數(shù)10%～29%；陽性（++），p53、MDM2陽性細(xì)胞數(shù)30%～59%；強(qiáng)陽性（+++），p53、MDM2陽性細(xì)胞數(shù)＞59%。PCNA判定標(biāo)準(zhǔn)為，連續(xù)觀察5～10個(gè)含表皮的高倍鏡視野，觀察每個(gè)視野PCNA陽性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞染色陽性率以半定量4個(gè)等級(jí)表示。陰性（-），未見陽性細(xì)胞；弱陽性（+），平均每高倍鏡視野陽性細(xì)胞數(shù)＜20%；陽性（++），平均每高倍鏡視野陽性細(xì)胞數(shù)20%～50%；強(qiáng)陽性（+++），平均每高倍鏡視野陽性細(xì)胞數(shù)＞50%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；兩變量之間的比較采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 p53蛋白的表達(dá)：p53蛋白陽性表達(dá)為胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒著色。結(jié)果顯示，30例皮膚鱗癌中，4例弱陽性表達(dá)，7例陽性表達(dá)，6例強(qiáng)陽性表達(dá)，其陽性表達(dá)率為56.67%（17/30）；15例正常皮膚組織中僅2例在基底細(xì)胞層散在陽性表達(dá)，其陽性表達(dá)率為13.33%（2/15）。皮膚鱗癌中p53蛋白表達(dá)明顯高于正常皮膚組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.697，P＜0.05）。

2.2 MDM2蛋白的表達(dá)：MDM2陽性表達(dá)為細(xì)胞核或胞漿著色。30例皮膚鱗癌中，5例弱陽性表達(dá)，8例陽性表達(dá)，13例強(qiáng)陽性表達(dá)，其陽性表達(dá)率為86.67%（26/30）。15例正常皮膚組織中3例在表皮細(xì)胞和附屬器細(xì)胞可見弱陽性表達(dá)，其陽性表達(dá)率為20.00%（3/15）。皮膚鱗癌中MDM2蛋白表達(dá)明顯高于正常皮膚組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 19.397，P＜0.05）。

2.3 PCNA蛋白的表達(dá)：PCNA陽性表達(dá)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。30例皮膚鱗癌組織中，4例弱陽性表達(dá)，10例陽性表達(dá)，13例強(qiáng)陽性表達(dá)，其陽性表達(dá)率為90.00%（27/30）。15例正常皮膚組織中9例在表皮細(xì)胞及附屬器細(xì)胞中可見弱陽性表達(dá)，多數(shù)集中表達(dá)于基底層細(xì)胞，其陽性表達(dá)率為60.00%（9/15）。皮膚鱗癌中PCNA蛋白表達(dá)明顯高于正常皮膚組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.625，P＜0.05）。

2.4 p53、MDM2與PCNA的相關(guān)性：在皮膚鱗癌組織中，p53與PCNA蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.512，P＜0.01），MDM2與PCNA蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r= 0.461，P＜0.01）。

3 討 論

皮膚鱗癌由表皮正常角質(zhì)形成細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變而成，好發(fā)于皮膚暴露部位，發(fā)病率呈逐年增高的趨勢［1］。p53基因是一個(gè)抑癌基因，參與細(xì)胞周期、細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡、DNA損傷和修復(fù)的調(diào)控，在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有中樞地位。p53蛋白表達(dá)與p53基因錯(cuò)義存在相關(guān)性。因此，一般可以認(rèn)為組織化學(xué)檢測的p53蛋白代表突變后的產(chǎn)物［2］。皮膚鱗癌中p53蛋白表達(dá)陽性率報(bào)道結(jié)果不一。Batinac等［3］報(bào)道皮膚鱗癌中p53蛋白表達(dá)陽性率高達(dá)80%。有報(bào)道［4］顯示p53基因在皮膚鱗癌中突變率為50%，代表腫瘤發(fā)生的早期事件，與晚期轉(zhuǎn)移及預(yù)后無關(guān)。p53表達(dá)可反應(yīng)腫瘤的惡性程度，預(yù)測皮膚鱗癌侵襲發(fā)展［3］。本研究結(jié)果顯示，皮膚鱗癌中p53蛋白陽性表達(dá)率為56.67%（17/30），提示皮膚鱗癌中存在p53突變。

MDM2作為p53基因轉(zhuǎn)錄激活的產(chǎn)物，通過加速p53蛋白的降解而下調(diào)p53蛋白及自身的水平，是維持機(jī)體生理功能的一種重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。MDM2基因擴(kuò)增或蛋白表達(dá)過量時(shí)，會(huì)打破這種平衡機(jī)制而促進(jìn)細(xì)胞增殖。韓幫鋒等［5］研究表明MDM2在口腔白斑和鱗癌中高表達(dá)，并隨組織惡性程度增高呈上升趨勢。李超霞等［6］研究表明在食道鱗癌中MDM2蛋白過表達(dá)，MDM2表達(dá)可能發(fā)生在食管癌變的晚期。我們采用免疫組織化學(xué)方法研究了皮膚鱗癌中MDM2的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDM2在癌巢可見胞漿或胞核內(nèi)棕黃色著色，其表達(dá)高于正常皮膚組織，推測MDM2過度表達(dá)可能參與了皮膚鱗癌的惡性增殖過程。

本研究中p53蛋白和MDM2蛋白水平均升高，可能是由于皮膚鱗癌遭受刺激后，細(xì)胞發(fā)生惡性增生誘導(dǎo)p53蛋白發(fā)生突變，MDM2異常表達(dá)，p53、MDM2反饋環(huán)破壞。隨著對(duì)其研究的進(jìn)一步深入，將為更好理解皮膚鱗癌的發(fā)生和發(fā)展過程及其臨床治療提供可能的新靶點(diǎn)。

PCNA又稱為周期蛋白，是伴隨細(xì)胞增殖而表達(dá)的一種核內(nèi)蛋白，在細(xì)胞核內(nèi)陽性表達(dá)的高低與細(xì)胞的增殖活性密切相關(guān)，它的這一生理功能可以評(píng)估細(xì)胞的增殖狀態(tài)，被廣泛用于惡性腫瘤及一些增生性疾病的研究。本研究結(jié)果顯示PCNA蛋白在皮膚鱗癌組織中的表達(dá)顯著增加，表明PCNA可反映皮膚鱗癌的惡性增殖過程。本研究結(jié)果顯示p53、MDM2蛋白在皮膚鱗癌中表達(dá)均增加，且均與PCNA存在相關(guān)性，表明兩者均參與了皮膚鱗癌的惡性增殖過程。

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［5］韓幫鋒，吳平凡，潘劍，等.鼠雙微粒體2蛋白、P53在口腔白斑和鱗癌中的表達(dá)及其相關(guān)性的研究［J］.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，29（1）：79-82.

［6］李超霞，方力，楊小紅，等.MDM2、P53和P27蛋白在食管鱗癌及其癌旁組織中的表達(dá)及其意義［J］.癌變·畸變·突變，2009，21（5）：362-366.

（本文編輯：劉斯靜）

EXPRESSIONS OF p53，MDM2 AND PCNA IN CUTANEOUS SQUAMOUS CELL CARCINOMA

LI Xiaojing1，LI Liujun2，ZHANG Xiujuan1，LI Zhifeng1
（1.Department of Dermatology，the Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering，Handan 056002，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，the First Hospital of Yongnian County，Hebei Province，Yongnian 057150，China）

ObjectiveTo investigate the expression of p53，murine double mimute 2（MDM2）and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）in cutaneous squmous cell carcinoma and their significance.MethodsSkin specimens were obtained from the lesions of 30 patients with cutaneous squamous cell carcinoma and normal skin of 15 healthy controls.Immunocytochemistry was used to detect the protein expression of p53，MDM2 and PCNA.ResultsThe cutaneous squamous cell carcinoma tissue specimens were significantly differed from the control tissue specimens in the expression rate of p53（χ2= 7.697，P＜0.05），MDM2（χ2=19.397，P＜0.05）and PCNA（χ2=5.625，P＜0.05）.ConclusionThe expression of p53，MDM2 and PCNA is significantly higher in cutaneous squamous cell carcinoma than in normal skin tissue.The high expression of p53 and MDM2 may play a significant role in the processes of carcinogenesis of cutaneous squamous cell carcinoma.

skin neoplasms；genes，p53；proto-oncogene proteins c-mdm2；proliferating cell nuclear antigen

R739.5

A

1007-3205（2012）12-1412-03

2012-08-29；

2012-11-19

李小靜（1980-），女，河北邯鄲人，河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事皮膚病理研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.12.017