VEGF-C mRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與腫瘤發(fā)展的關(guān)系

裴永彬，賀新奇，孟麗敏，劉 云，趙增仁

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科，河北石家莊050031）

VEGF-C mRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與腫瘤發(fā)展的關(guān)系

裴永彬，賀新奇，孟麗敏，劉 云，趙增仁*

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科，河北石家莊050031）

目的檢測(cè)結(jié)直腸癌中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）mRNA水平的表達(dá)，探討其與腫瘤發(fā)展的關(guān)系及臨床意義。方法選取臨床及病理資料完整的結(jié)直腸癌患者42例，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)手術(shù)切除的結(jié)直腸癌標(biāo)本及配對(duì)的正常結(jié)直腸黏膜組織中VEGF-C mRNA的表達(dá)，分析其與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果在42例配對(duì)結(jié)腸癌標(biāo)本中，癌與對(duì)應(yīng)正常黏膜VEGF-C mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.545±0.273、0.494±0.330，在癌組織中輕度高表達(dá)，但二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Duke分期C及D期患者VEGF-C mRNA水平明顯高于A和B期（0.724±0.210 vs 0.445±0.257，P＜0.05）；TNM分期Ⅲ+Ⅳ期較Ⅰ+Ⅱ期VEGF-C mRNA有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.660±0.230 vs 0.401±0.317，P＞0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF-C mRNA也呈高表達(dá)狀態(tài)（0.773±0.159 vs 0.473±0.264，P＜0.05）；VEGF-C mRNA在腫瘤浸潤(rùn)超過(guò)漿膜層的患者表達(dá)水平高（P＜0.05）；VEGF-C mRNA在不同性別、年齡、腫瘤位置及分化程度分組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論結(jié)直腸癌組織中VEGF-C mRNA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲有關(guān)，可作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子應(yīng)用于結(jié)直腸癌患者的病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷。

結(jié)直腸腫瘤；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；免疫組織化學(xué)

血管和淋巴管是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。它們是受腫瘤細(xì)胞表達(dá)的促血管、淋巴管生成因子刺激而形成的。腫瘤細(xì)胞營(yíng)造了一個(gè)適合腫瘤生長(zhǎng)（包括血管、淋巴管生成）的間質(zhì)微環(huán)境；這個(gè)微環(huán)境除了與腫瘤細(xì)胞相互作用的間質(zhì)細(xì)胞，還包括一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)［1］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族中的分子是其中目前研究最火熱的細(xì)胞因子，特別是VEGF-C［2-3］和VEGF-D。免疫組織化學(xué)研究提示VEGF-C和VEGF-D在結(jié)直腸癌侵襲的邊緣，并且與淋巴轉(zhuǎn)移這個(gè)臨床特征有關(guān)，但是關(guān)于兩者mRNA水平的表達(dá)一直存在爭(zhēng)議［4］。本文就VEGF-C在結(jié)直腸癌中的mRNA水平進(jìn)行了研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2007—2009年河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院經(jīng)病理診斷證實(shí)的結(jié)直腸癌患者42例，男性25例，女性17例，年齡31～90歲，平均（61.00± 3.75）歲。收集手術(shù)切除結(jié)直腸癌標(biāo)本及配對(duì)的正常結(jié)直腸黏膜組織。癌標(biāo)本取材于瘤體的邊緣，而正常組織取材遠(yuǎn)離癌標(biāo)本達(dá)5cm以上。所有標(biāo)本在離體后15min內(nèi)放入液氮，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 VEGF-C mRNA檢測(cè)方法：采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法。取新鮮組織50mg置于無(wú)RNA酶的勻漿器中，快速加入Trizol 1mL勻漿，按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。分光光度計(jì)檢測(cè)其吸光度，其OD260/280值為1.8～2.0，經(jīng)1%瓊脂糖［含溴化乙烷（ethidium bromide，EB）0.5mg/mL］電泳可見(jiàn)28S、18S兩條亮帶并且亮度呈2∶1關(guān)系，說(shuō)明總RNA無(wú)降解。取2μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用primer 5軟件設(shè)計(jì)VEGF-C的引物序列，以管家基因β-actin作為內(nèi)參照。反應(yīng)條件，95℃30s，54℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳（100V，1h），置紫外燈下拍照后進(jìn)行面積灰度掃描。計(jì)算目的基因產(chǎn)物與β-actin基因RT-PCR產(chǎn)物吸光度容積之比值作為目的基因mRNA的相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在42例配對(duì)結(jié)腸癌標(biāo)本中，癌與正常組織的VEGF-C相對(duì)表達(dá)量分別為0.545±0.273、0.494±0.330，癌組織中VEGF-C輕度高表達(dá)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Duke分期C+D期患者mRNA水平明顯高于A+B期（0.724±0.210 vs 0.445±0.257，P＜0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGFC表達(dá)也呈高表達(dá)狀態(tài)（0.773±0.159 vs 0.473± 0.264，P＜0.05）；TNM分期Ⅲ+Ⅳ期的VEGF-C有升高趨勢(shì)（0.660±0.230 vs 0.401±0.317，P＞0.05）；VEGF-C在浸潤(rùn)超過(guò)漿膜層的患者表達(dá)水平高（0.653±0.268 vs 0.427±0.247，P＜0.05）。VEGF-C mRNA表達(dá)水平在不同性別、年齡、腫瘤位置及分化程度分組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 VEGF-C mRNA在腫瘤組織中表達(dá)量與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 1 Correlation of VEGF-C mRNA expression with clinicopathologic features in colorectal tumor（±s）

表1 VEGF-C mRNA在腫瘤組織中表達(dá)量與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 1 Correlation of VEGF-C mRNA expression with clinicopathologic features in colorectal tumor（±s）

ParametersnVEGF-C mRNA tP Sex Male Female 25 17 0.576±0.278 0.450±0.2720.6730.508 Age＞61 years≤61 years 20 22 0.608±0.297 0.487±0.2451.1140.277 Duke A+B C+D 27 15 0.445±0.257 0.724±0.2102.7810.011 Tumor location Dectum Colon 20 22 0.600±0.286 0.486±0.2561.0500.304 Depth of invasion Exceeding serosa Not exceeding serosa 22 20 0.653±0.268 0.427±0.2472.1320.045 Lymph node metastasis No Yes 26 16 0.473±0.264 0.773±0.1592.6100.016 TNMⅠ+ⅡⅢ+Ⅳ26 16 0.401±0.317 0.660±0.2301.8500.075 Differentiation Low High 11 31 0.562±0.278 0.547±0.2740.1040.920

3 討 論

眾所周知，結(jié)直腸癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式是淋巴轉(zhuǎn)移，并且是否發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移是預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。盡管目前人們普遍認(rèn)為結(jié)直腸癌淋巴管生成在轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用，但在淋巴管密度與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系問(wèn)題上仍未達(dá)成一致。Furudoi等［5］認(rèn)為腫瘤表面的VEGF-C表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征無(wú)明顯關(guān)系。Hanrahan等［6］研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。還有研究顯示結(jié)直腸腫瘤中VEGF-C表達(dá)水平?jīng)]有升高［7］。本研究檢測(cè)了42例結(jié)直腸癌組織及其配對(duì)正常黏膜組織VEGF-C mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在癌組織中其表達(dá)水平有升高的趨勢(shì)，這可能與取材靠近腫瘤邊緣有關(guān)。研究顯示VEGF-C表達(dá)在腫瘤邊緣明顯增高［8］。多種體內(nèi)模型顯示過(guò)表達(dá)VEGFC和VEGF-D可以促進(jìn)腫瘤侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而這個(gè)作用會(huì)被游離VEGFR-3或VEGF-D單克隆抗體以及作用于VEGF-C的siRNA抑制［9］。免疫組織化學(xué)研究顯示VEGF-C的高表達(dá)與淋巴管密度、TNM分期、腫瘤轉(zhuǎn)移等臨床特征有關(guān)［10-13］。我們發(fā)現(xiàn)TNM分期較低者（Ⅰ+Ⅱ）VEGF-C表達(dá)較低，而侵襲深度超過(guò)漿膜層患者其表達(dá)水平明顯升高。

Zhang等［14］研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C與胰島素樣生長(zhǎng)因子受體同時(shí)高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有很強(qiáng)的的相關(guān)性，而且在表達(dá)胰島素樣生長(zhǎng)因子受體的結(jié)直腸癌細(xì)胞中，胰島素樣生長(zhǎng)因子刺激能導(dǎo)致VEGF-C mRNA表達(dá)的升高。Du等［10］研究顯示VEGF-C與高轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Duke分期有關(guān)。本研究顯示在Duke C+D期VEGF mRNA水平明顯升高，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

大腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，盡管其分子機(jī)制尚未完全闡明，但VEGF-C在促進(jìn)大腸癌淋巴管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。臨床分析顯示VEGF-C與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲有關(guān)，可以作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子應(yīng)用于大腸癌患者的病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷。這些研究的深入將為大腸癌轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療提供新的方向和思路。

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（本文編輯：趙麗潔）

RELATIONSHIP BETWEEN THE EXPRESSION OF VEGF-C mRNA AND TUMOR EVOLUTION IN COLORECTAL CANCER

PEI Yongbin，HE Xinqi，MENG Limin，LIU Yun，ZHAO Zengren*
（Department of General Surgery，the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050031，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of vascular endothelial growth factor-C（VEGF-C）mRNA and tumor evolution in colorectal cancer.MethodsForty-two colorectal cancer tissues and normal tissues were selected randomly，reverse transcriptionpolymerase chain reaction（RT-PCR）was used to detect the expression of VEGF-C mRNA.All specimens had complete clinicopathologic data.ResultsRT-PCR showed the expression of VEGF-C mRNA in colorectal cancer and normal tissue were 0.545±0.273 and 0.494±0.330，respectively. However，VEGF-C mRNA was mildly high expressed in adenoma tissues，but there was no significance compared with the normal tissues（P＞0.05）.The expression of VEGF-C mRNA in Dukes C+D were significantly higher than Dukes A+B（0.724±0.210 vs 0.445±0.257，P＜0.05）.There was an increasing tendency of VEGF-C mRNA expression in TNM stageⅢ+Ⅳ（0.660±0.230 vs 0.401± 0.317，P=0.075），and high expression in lymph node metastasis group（0.773±0.159 vs 0.473± 0.264，P＜0.05）.The expression of VEGF-C mRNA were closely correlated with lymph node metastasis（P＜0.05），but not with patient's sex，age，differentiation degree and tumor location（P＞0.05）.ConclusionThis study suggests that the expression of VEGF-C mRNA in CRC is associatedwith lymph node metastasis and invasion depth，and it may be used as an independent factor for disease surveillance and prognosis assessment.

colorectal neoplasms；vascular endothelial growth factor C；immunohistochemistry

R735.3

A

1007-3205（2012）12-1396-03

2012-06-04；

2012-11-23

河北省衛(wèi)生廳青年科技課題（20100263）

裴永彬（1977-），男，河北邯鄲人，河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事普外科疾病診治研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.12.012