足細(xì)胞相關(guān)蛋白對糖尿病腎病的影響

李思佳，劉育軍

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 200062；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院 腎內(nèi)科,上海 200062)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)微血管并發(fā)證之一，其發(fā)病率及病死率均較高，其確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。美國的一項研究表明，病程超過25年的DM患者約有25%～40%的DM發(fā)生DN，而約有40%的ESRD是因糖尿病腎病引起的[1]。DN最顯著的臨床特征是尿蛋白排泄增加，從微量白蛋白排泄增多漸進(jìn)發(fā)展至大量蛋白尿，而蛋白尿又是加重腎損害的危險因素之一。蛋白尿的發(fā)生與腎小球濾過屏障的結(jié)構(gòu)和功能改變有著密切的關(guān)系。 足細(xì)胞是附著在腎小球基底膜外的高度分化的細(xì)胞,它與GBM、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成了腎小球濾過屏障,近年來研究[2]證明足細(xì)胞損傷在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。隨著對足細(xì)胞的深入研究，發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞裂孔隔膜上有與腎小球濾過屏障功能及蛋白尿發(fā)生密切相關(guān)的重要物質(zhì)，這些足細(xì)胞相關(guān)蛋白對糖尿病發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。

1 足細(xì)胞生理結(jié)構(gòu)和功能

腎小球臟層上皮細(xì)胞(glomerular visceral epithelialcel1)又稱足細(xì)胞(Podocyte)，是一種終末分化多突狀細(xì)胞,可分為結(jié)構(gòu)和功能不同的3部分，即細(xì)胞體、主突和足突。細(xì)胞體和主突分布于腎小球囊腔側(cè)并通過足突與腎小球基底膜相連。足突分頂部、基底部及裂隙隔膜(Slit diaphragm，SD)。足突是足細(xì)胞的標(biāo)志性特征，通過α3β1整合素復(fù)合體和α-β-蛋白聚糖復(fù)合體連接于腎小球基底膜上[3]。Dalla Vestra等[4]對白種人Ⅱ型DM患者的研究也發(fā)現(xiàn)有腎小球足細(xì)胞密度和數(shù)量減少、足突寬度增加等改變，且尿白蛋白排泄率(UAER)與足細(xì)胞密度呈反相關(guān)，與足突寬度呈正相關(guān)；足細(xì)胞還可發(fā)生肥大、變性，進(jìn)而從GBM上脫落、丟失，致使硬化腎小球的GBM廣泛裸露，持續(xù)性損傷將導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡，最終進(jìn)展終末期腎功能衰竭[5]。

2 足細(xì)胞相關(guān)蛋白分子對DN的影響

2.1 Nephrin Nephrin是跨膜蛋白的蛋白,它是免疫球蛋白超家族的一種含1 241個殘基的細(xì)胞黏附分子，被認(rèn)為是SD拉鏈狀結(jié)構(gòu)的一部分，分子量為135KD。在其c端富含絲氨酸和酪氨酸殘基。它與配體結(jié)合時，某些酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化而介導(dǎo)細(xì)胞間的信號傳遞。有研究[7]報道，新生小鼠足細(xì)胞開始分化、裂孔隙隔膜形成初期就有nephrin表達(dá)。

Nephrin與足細(xì)胞胞漿內(nèi)的ZO-1、肌動蛋白等緊密連接并與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白相互作用以維持足細(xì)胞的正常形態(tài)和功能，其基因和(或)蛋白表達(dá)異常在蛋白尿的發(fā)生機(jī)制中有重要作用。對糖尿病患者研究[8]發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下腎小球足細(xì)胞Nephrin表達(dá)減少，尿蛋白排泄增加，提示DN發(fā)病可能與Nnphrin表達(dá)下調(diào)而增加GBM通透性和基質(zhì)沉積有關(guān)。Forbes JM等[9]的動物模型也發(fā)現(xiàn)DN早期nephrin mRNA表達(dá)增加，尿中出現(xiàn)nephrin蛋白，后期nephrin mRNA表達(dá)逐漸下降，由此推測DN早期nephrin mRNA表達(dá)增加是對nephrin蛋白從尿中丟失的代償性變化。

足細(xì)胞nephrin表達(dá)減少可能通過下述途徑致糖尿病腎病進(jìn)展及尿白蛋白排泄率增加:1)相鄰足突裂孔隔膜分子篩結(jié)構(gòu)破壞，失去腎小球選擇性濾過最后屏障。2)肌動蛋白細(xì)胞骨架的重排和足突的消失。3)nephrin-CD2AP-podocin復(fù)合體是足細(xì)胞抗凋亡信號的關(guān)鍵[10]。

2.2 Podocin Podocin是繼nephrin之后新近發(fā)現(xiàn)的一種蛋白因子，分子量42KD,存在于裂孔膜上呈發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，插入細(xì)胞膜，折疊處位于膜表面。體內(nèi)外研究[11]證實podocin羧基末端與nephrin胞內(nèi)段羧基末端及CD2AP相互作用形成蛋白復(fù)合體，介導(dǎo)SD與足細(xì)胞骨架相連，增強(qiáng)nephrin信號傳導(dǎo)。同時Kawachi[12]研究還發(fā)現(xiàn)podocin和nephrin可能具有親和性，蛋白尿時，二者的表達(dá)都呈下降趨勢，進(jìn)一步證明二者變化部位幾乎相同，從而推測二者的協(xié)同表達(dá)是維持SD通透性的重要因素。

在同時研究podocin和nephrin在DN中表達(dá)變化的實驗中,Wu Yc等[13]對DN大鼠通過Westernblot等方法研究發(fā)現(xiàn)腎小球足細(xì)胞中podocin和nephrin蛋白的表達(dá)明顯降低。

2.3 CD2AP CD2AP是一種分子量約80kD，富含SH3(Srchomolog 3)結(jié)構(gòu)的連接蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。其主要功能是通過其在T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞間的特異性連接中表達(dá)，結(jié)合CD2黏附分子胞質(zhì)區(qū)，將其與細(xì)胞骨架相連，促進(jìn)T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞的黏附，從而使抗原呈遞得以進(jìn)行。CD2AP在足細(xì)胞中的功能主要是與nephrin及podocin結(jié)合參與足細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究[14]已證實CD2AP的C末端功能區(qū)與Nephrin的胞漿末端結(jié)合，在Nephrin和肌動蛋白細(xì)胞骨架間起橋梁作用。palmen等[15]通過免疫共沉淀試驗發(fā)現(xiàn)，CD2AP可經(jīng)其羧基端的第3個SH3結(jié)構(gòu)域和nephrin直接發(fā)生相互作用。

Iyengar等[16]應(yīng)用連鎖分析未發(fā)現(xiàn)212例有家族史的糖尿病腎病患者的發(fā)病與CD2AP相關(guān)，Benigni等[17]的研究中發(fā)現(xiàn)DN患者中nephrin的表達(dá)明顯降低，而podocin和CD2AP的表達(dá)沒有明顯的變化，并且認(rèn)為nephrin的表達(dá)降低和podocin、CD2AP的正常表達(dá)可能是DN的特征之一。

2.4 a-actinin-4 a-actinin-4是一種足細(xì)胞骨架蛋白，足細(xì)胞骨架支撐足細(xì)胞的細(xì)胞體、主突和足突，在維持足細(xì)胞正常形態(tài)和功能上發(fā)揮著重要作用。a-actinin-4分子是一種actinin微絲交聯(lián)蛋白，可將松散的肌動蛋白交聯(lián)成具有收縮能力的纖維束，對于錨定纖維束至胞漿膜具有輔助作用。在足細(xì)胞中以Nephrin、Podocin、CD2AP為中心組成的裂隙膈膜復(fù)合體也直接或間接地與a-actinin-4 相聯(lián)系[18]。它的基因突變可引起的遺傳性家族性局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)即表現(xiàn)為足細(xì)胞足突融合消失和SD結(jié)構(gòu)破壞[19]。

Kimura M等[20]對17例糖尿病腎病患者腎組織通過原位雜交和免疫組化，發(fā)現(xiàn)a-actinin-4 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低。Ha.TS[21]在體外研究發(fā)現(xiàn)，高糖與糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)聯(lián)合干預(yù)下，足細(xì)胞a-actinin-4的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致DN腎小球足細(xì)胞骨架破壞。有研究表明，a-actinin-4表達(dá)改變可能是造成足突融合以致發(fā)生蛋白尿的原因[22]。

2.5 ZO-1 ZO-1是一個225KD鳥氨酸激酶家族的緊密連接蛋白,位于SD插入足突處的胞質(zhì)側(cè)，主要表達(dá)在足突上，能和actin 細(xì)胞骨架相互作用，將SD蛋白連接至肌動蛋白細(xì)胞骨架上，對穩(wěn)定足突結(jié)構(gòu)非常重要[23]。Fukasawa等[24]研究認(rèn)為，裂孔隔膜上存在緊密連接蛋白(JAM)，可緊密連接足突和GBM，使其不易從GBM上脫落。ZO-1可能通過酪氨酸磷酸化參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其分布異常和酪氨酸磷酸化可能與nephrin同源蛋白NEPH1羧基端最后3個氨基酸結(jié)合和相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)骨架與足突重排，從而引起足細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能的改變，導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生[25]。

Rincon-Choles H等[26]通過免疫組化和WesternWesternblot對Ⅰ型和Ⅱ型DN小鼠模型的研究表明，裂孔膜上的ZO-1在糖尿病小鼠的腎小球上表達(dá)減少，ZO-1可從足細(xì)胞膜上重新分布到細(xì)胞質(zhì)中,提示ZO-1濃度和位置的改變可能與DN蛋白尿的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。Macconi D等[27]在血管緊張素Ⅱ干預(yù)了的足細(xì)胞的實驗研究中發(fā)現(xiàn)了ZO-1重分布和選擇通透性障礙,并以此推測ZO-1的分布及表達(dá)改變在蛋白尿的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮作用。

2.6 podocalyxin 足細(xì)胞頂膜區(qū)一重要成分即podocalyxin。Podocalyxin是一種CD34相關(guān)的跨膜糖蛋白，富含唾液酸，在足細(xì)胞表面形成多聚糖蛋白復(fù)合物是腎小球濾過膜負(fù)電荷屏障的主要組成成分。podocalyxin表面電荷具有抗黏附作用，可以防止帶負(fù)電荷的蛋白分子從裂孔隔膜中漏入原尿中，podocalyxin蛋白的正常表達(dá)是保證腎小球濾過膜電荷屏障的基礎(chǔ)，能夠抵制相鄰足突間及其與基質(zhì)間的黏附，維持其獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)[28]。

Koop K等[29]在有蛋白尿的腎小球疾病(局灶節(jié)段性腎小球硬化、微小病變、糖尿病腎病、IgA腎病等)患者的腎活檢組織中發(fā)現(xiàn)腎小球podocalyxin蛋白表達(dá)低于正常對照組；Nakaln T等[30]研究發(fā)現(xiàn)隨著DN病程由微量蛋白尿到大量蛋白尿的形成，足細(xì)胞在尿中的檢測也有顯著差異性，通過應(yīng)用podocalyxin抗體檢測尿中足細(xì)胞數(shù)量可以作為預(yù)測DN嚴(yán)重性和指導(dǎo)治療的一種指標(biāo)。

3 小結(jié)與展望

近年來的研究都已經(jīng)證實在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展過程中，足細(xì)胞在其中起著關(guān)鍵的作用。在高血糖、TGF-β和血管緊張素Ⅱ等致病因素作用下,足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白、細(xì)胞骨架蛋白及細(xì)胞骨架與裂孔隔膜之間緊密連接蛋白和頂膜區(qū)蛋白表達(dá)的改變，繼而出現(xiàn)足突融合，足細(xì)胞從基底膜上脫離，腎小球濾過屏障通透性增高等結(jié)構(gòu)改變，促進(jìn)局灶節(jié)段性腎小球硬化的發(fā)生，腎功能下降，出現(xiàn)蛋白尿。因此研究足細(xì)胞相關(guān)蛋白分子的表達(dá)改變及相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)措施可為糖尿病腎病早期防治帶來新的希望。目前對足細(xì)胞相關(guān)蛋白分子對DN及蛋白尿影響的研究還有許多不完善之處，值得進(jìn)一步探索研究。

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