藍氏賈第鞭毛蟲檢測技術(shù)研究進展

鄧明俊，肖西志，孫 濤，孫 敏，鄭小龍，王 群，張曉文，孫明君，朱來華

（山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266002）

藍氏賈第鞭毛蟲（Giardia lamblia，簡稱賈第鞭毛蟲）是一種重要的人獸共患寄生蟲原蟲，也是人體腸道感染的常見寄生蟲病之一，常引起人的腹瀉、腹痛和消化不良等癥狀。賈第鞭毛蟲分布于世界各地，近十多年來，由于旅游事業(yè)的發(fā)展，在旅游者中發(fā)病率較高，故又稱“旅游者腹瀉”。起初，人類對賈第鞭毛蟲的認識還不夠深入，認為該蟲只是一種共生性的腸道原蟲。隨著后來世界各地相繼發(fā)生了賈第鞭毛蟲病的暴發(fā)和流行，其危害性不斷顯現(xiàn)，人類才真正開始了對該寄生原蟲的深入研究。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計，全世界人群賈第鞭毛蟲感染率為1%～30%，兒童感染率最高。因此，該寄生原蟲已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為危害人類身體健康重要寄生蟲之一。為使大家能對藍氏賈第鞭毛蟲病以及相關(guān)檢測技術(shù)有一個全面的認識和了解，本文對近年來國內(nèi)外藍氏賈第鞭毛蟲最新檢測技術(shù)研究進展進行如下綜述。

1 賈第鞭毛蟲的生理特性

1.1 生活史

賈第鞭毛蟲的生活史屬人際傳播型，整個過程中有滋養(yǎng)體和包囊兩個不同的發(fā)育階段。滋養(yǎng)體呈倒置梨形，兩側(cè)對稱，背面隆起，腹面扁平。腹面前半部向內(nèi)凹陷成吸盤狀陷窩，賈第鞭毛蟲借此吸附在宿主腸黏膜上。滋養(yǎng)體有4對鞭毛，依靠鞭毛的擺動，可隨意運動。滋養(yǎng)體期以滲透方式從體表吸收營養(yǎng)物質(zhì)。賈第鞭毛蟲的包囊呈橢圓形，囊壁較厚。包囊經(jīng)過碘液染色呈黃綠色，囊壁與蟲體之間有明顯的空隙，未成熟的包囊有2個核，成熟的包囊具4個核，多偏于一端。滋養(yǎng)體為營養(yǎng)繁殖階段，而包囊為傳播階段。滋養(yǎng)體主要寄生于人和某些動物的十二指腸或上段小腸，偶爾寄生于膽道或胰管，以二分裂方式進行繁殖。包囊對外界環(huán)境的抵抗力較強，為傳播階段。

1.2 流行特征

賈第鞭毛蟲的包囊對人具有高度的感染性，任何人群對賈第鞭毛蟲均易感。據(jù)報道，人吞食10個具有活力的賈第鞭毛蟲包囊即可感染此病，兒童、年老體弱者、免疫功能低下者、旅游者對本蟲更易感。感染了賈第鞭毛蟲的人及動物為賈第鞭毛蟲病的主要傳染源，動物保蟲宿主要包括有牛、馬、羊、豬、兔、如、貓、狗等。此外，很多野生動物（如狼、美洲駝、河貍等）也可通過糞便排出具有感染性的包囊。

賈第鞭毛蟲有多種感染途徑與傳播方式，其中水源傳播是傳播本蟲的重要途徑。20世紀90年代，賈第鞭毛蟲曾為美國7種經(jīng)水源傳播的原蟲之首。另外，接觸傳播也是導致賈第鞭毛蟲病流行或暴發(fā)的主要途徑。學校、幼兒園人群聚集的地方，以及家庭成員之間，人與人之間的密切接觸極其容易導致該蟲在人群間傳播而感染發(fā)病。此外，通過飲食了含有污染有賈第鞭毛蟲包囊的食物或飲料，或是飲用了不干凈的水都可感染賈第鞭毛蟲病。

2 賈第鞭毛蟲的流行因素

2.1 社會因素

賈第鞭毛蟲的流行暴發(fā)在一定程度上與當?shù)氐慕?jīng)濟及社會發(fā)展水平、人們的受教育程度、生活方式及衛(wèi)生意識等有著積極密切的關(guān)系。在經(jīng)濟發(fā)展落后，居住條件和公共衛(wèi)生條件差，老百姓衛(wèi)生意識落后的地區(qū)，賈第鞭毛蟲病的流行就相對較為普遍。在許多貧窮落后的山區(qū)或是農(nóng)村地區(qū)，由于清潔供水系統(tǒng)不完善，飲水衛(wèi)生條件差，該類地區(qū)經(jīng)常暴發(fā)經(jīng)飲水而傳播賈第鞭毛蟲病。此外，從賈第鞭毛蟲非流行區(qū)進入流行區(qū)旅游的人、學校等集體生活的兒童或衛(wèi)生習慣差的兒童，賈第鞭毛蟲的感染率也相對較高。

2.2 自然因素

賈第鞭毛蟲感染流行的自然因素主要包括氣候條件（如氣溫、降水量、干濕度等）和經(jīng)緯度、海拔高度等地理因素。這些自然因素可直接影響到賈第鞭毛蟲包囊在外界的存活時間和感染活力，從而影響賈第鞭毛蟲病的流行和暴發(fā)。研究表明，氣溫與賈第鞭毛蟲感染率呈顯著正相關(guān)關(guān)系。賈第鞭毛蟲包囊對外界環(huán)境有較強的抵抗力，在水中和涼爽環(huán)境中可存活數(shù)天至1月之久，在經(jīng)氯（0.5%）消毒的水中可存活2d～3d，在人活動物體外排出的糞便中包囊的感染活力可維持10d以上。賈第鞭毛蟲包囊對低溫有較強的耐受性，在4℃環(huán)境中可存活2個月以上，但在50℃以上高溫或干燥環(huán)境下抵抗力較弱易死亡。因此，在冷濕的季節(jié)，賈第鞭毛蟲包囊在外界存活時間較長，感染率也較高。此外，包囊在蒼蠅的消化道中可存活24h，在蟑螂消化道內(nèi)也可存活12d之久。由此，賈第鞭毛蟲包囊也可能通過蒼蠅、蟑螂這類節(jié)肢動物體機械性的傳播方式間接傳染人類。

3 賈第鞭毛蟲病的危害

賈第鞭毛蟲病為人體腸道感染的常見寄生蟲病之一，常常引起腹瀉、腹痛和消化不良。賈第鞭毛蟲感染導致的病變多累及十二指腸及空腸上段，嚴重者膽囊、膽管，回腸末端、闌尾、結(jié)腸，膜管，肝管等均可受到侵襲。若嚴重感染得不到及時治療，病程會持續(xù)很久，并可造成營養(yǎng)吸收不良和兒童發(fā)育遲緩。另外，賈第鞭毛蟲常與艾滋病合并感染而危機生命。

賈第鞭毛蟲病呈全球性分布，在熱帶和溫帶，甚至寒帶地區(qū)都有流行或暴發(fā)。20世紀70年代和80年代，賈第鞭毛蟲病的流行非常嚴重，該病不僅在發(fā)展中國家的流行，而且在美國、加拿大、英國、和澳大利亞等發(fā)達國也有暴發(fā)和流行。在我國賈第鞭毛蟲也呈全國性分布態(tài)勢，北起黑龍江省南至海南島，西從西藏東到東南沿海，均有本病的存在和區(qū)域性的流行。

4 賈第鞭毛蟲檢測技術(shù)

4.1 病原學檢測

病原學檢測賈第鞭毛蟲是賈第鞭毛蟲病確診的最直接的依據(jù)。生理鹽水直接涂片法、碘液包囊染色法、十二指腸引流液檢查法等都是通過涂片鏡檢賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體或包囊的最常用、最直接的確診方法。采集新鮮糞便做生理鹽水涂片或染色涂片后鏡檢，如果看到滋養(yǎng)體或包囊的存在，就可確診。但是因賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體對外界環(huán)境的抵抗力弱，在排出體外后數(shù)小時即死亡，為保持滋養(yǎng)體的活力，送檢的標樣必須要求保溫儲藏和運送。利用漂浮法檢測糞便樣品中的寄生蟲是目前臨床上使用廣泛，操作簡單、耗時短、較經(jīng)濟的檢測技術(shù)。Claerebout E等［1］利用飽和蔗糖漂浮法富集賈第鞭毛蟲包囊，成功對犬糞便樣本進行賈第鞭毛蟲檢測。但是該方法最大缺點是敏感性低，漏檢率高。因此，要想提高賈第鞭毛蟲的檢出率，對使用該方法的操作者提出了更高的要求，整個操作過程必須需要專業(yè)水平高，臨床經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員操作。除此之外，不斷優(yōu)化賈第鞭毛蟲的濃縮、分離和染色方法和程序，采用適當?shù)幕瘜W染色試劑和物理的機械振蕩方式，以及先進的儀器設(shè)備可有效提高包囊的回收率和檢出率。

4.2 免疫學檢測

免疫學檢測方法由于其特異性好、敏感性強，操作簡單，易于推廣使用的有點，在醫(yī)學領(lǐng)域、生物領(lǐng)域有著不可替代的應(yīng)用前景，將免疫學方法成功應(yīng)用到對賈第鞭毛蟲的檢測，開辟了賈第鞭毛蟲檢測的新途徑，并展現(xiàn)出良好的應(yīng)用和發(fā)展前景。

在免疫學檢測中技術(shù)當中，ELISA酶標檢測技術(shù)應(yīng)用最普遍、適用范圍最廣。它具有特異性強、敏感性高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性佳、高通量、耗時短、成本低等眾多優(yōu)勢。以藍氏賈第鞭毛蟲包囊為抗原，以新鮮采集的糞便樣本為檢測對象，借助酶標抗體，通過酶促顯色的放大作用，可有效檢測出多種樣本中微量的賈第鞭毛蟲包囊。Selim S等［2］對90份患者糞樣采用ELISA方法檢測賈第鞭毛蟲，其中46份（51.1%）檢出為陽性，靈敏度為97.3% ，特異度為82.6%。目前，國內(nèi)外均已有商業(yè)化的ELISA試劑盒廣泛用于對糞便等樣本中賈第鞭毛蟲的有效檢測。

免疫熒光技術(shù)（immunofluorescent technique，IFT）也是目前國內(nèi)外學者檢測賈第鞭毛蟲常用的方法之一。由于該法敏感性高、特異性強和重復(fù)性好的優(yōu)點，因而在賈第鞭毛蟲的檢測中應(yīng)用非常廣泛。Geurden T等［3］曾用直接免疫熒光法對犬的糞便樣本進行賈第鞭毛蟲檢測，檢出率明顯提高。免疫熒光法可用于檢測抗原，也可用于檢測抗體。Guimaraes S等［4］曾采用間接免疫熒光法對147份0～6歲兒童的血樣進行賈第鞭毛蟲抗體檢測，結(jié)果顯示該方法具有較高的敏感性和特異性。此外，免疫熒光技術(shù)對水中賈第鞭毛蟲的檢測已經(jīng)成為目前國際上通用的金標準方法。余素華等［5］采用濾囊過濾、振蕩洗脫、離心濃縮、免疫磁珠分離富集賈第鞭毛蟲包囊，然后采用免疫熒光染色和微分干涉相襯鏡檢計數(shù)相結(jié)合，成功檢測出水中的賈第鞭毛蟲包囊，為城市用水的安全衛(wèi)生提供了技術(shù)保障。然而，免疫熒光法的關(guān)鍵是要預(yù)先充分準備好針對不同靶抗原對應(yīng)的特異熒光抗體，而且實驗室必須備有熒光顯微鏡等必須設(shè)備。因此，該方法的成本相對較高。

4.3 分子生物學檢測

在對賈第鞭毛蟲的直接檢測中，對樣本中的包囊進行富集濃縮、涂片鏡檢是最傳統(tǒng)、最經(jīng)典的方法。隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，許多日新月異的分子生物學快速診斷方法相繼被國內(nèi)外科技工作者研發(fā)并應(yīng)用。比如PCR方法、套式PCR方法、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法、實時熒光定量PCR（Real-time PCR）方法，多重熒光PCR、PCR-限制性片段多態(tài)分析（PCR-RFLP）、環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）等分子生物學檢測技術(shù)都已經(jīng)成功應(yīng)用到對賈第鞭毛蟲的檢測當中。針對賈第鞭毛蟲的基因檢測技術(shù)已成為當前所有賈第鞭毛蟲檢測技術(shù)當中最快速、最敏感的診斷方法之一。

4.3.1 PCR PCR技術(shù)是20世紀80年代中期發(fā)展起來的一種體外核酸擴增技術(shù)，該技術(shù)已用于賈第鞭毛蟲臨床標本和環(huán)境水樣的檢測，其優(yōu)點是敏感、特異，能分辨基因型，簡便易行。Trout J M等［6］對狼的糞便利用PCR方法檢測糞樣中含有的賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲，首次報道了賈第鞭毛蟲的多種基因型。Marangi M等［7］對意大利貧困地區(qū)的兒童糞便樣本和犬糞樣本采用PCR技術(shù)檢測賈第鞭毛蟲感染情況，成功檢出5份兒童糞便和8份犬糞便樣本為賈第鞭毛蟲陽性，與傳統(tǒng)的糞便顯微鏡檢方法相比，PCR技術(shù)的敏感性大大提高。

4.3.2 套式PCR（nested-PCR） 套式PCR是指分別用兩套PCR引物進行兩輪PCR擴增，從極少量的模板中獲得較高濃度和純度的靶片段的擴增技術(shù)。國外很多學者將套式PCR應(yīng)用到對賈第鞭毛蟲的檢測和研究中，大大提高了賈第鞭毛蟲檢測的敏感性和可靠性。Miller K M等［8］采用套式PCR對賈第鞭毛蟲包囊進行敏感性試驗，結(jié)果顯示，該方法可有效檢測到單個賈第鞭毛蟲包囊。Ghosh S等［9］設(shè)計了2對引物對賈第鞭毛蟲rRNA的基因間隔區(qū)（intergenic spacer，IGS）進行兩輪擴增，成功檢出少于2pg的賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體的DNA。而且在對糞便樣品進行藍氏賈第鞭毛蟲的直接診斷中，通過套式PCR擴增IGS序列，顯示了更高的靈敏性和特異性，應(yīng)用該技術(shù)可檢測到100μL糞便樣本中的10個寄生蟲原蟲。

不僅如此，應(yīng)用套式PCR技術(shù)還可確定賈第鞭毛蟲的基因型。Helmy M M等［10］根據(jù)賈第鞭毛蟲的磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）基因，設(shè)計引物，建立套式實時PCR方法成功對賈第鞭毛蟲的兩個主要的基因型進行檢測。Mahdy A K等［11］根據(jù)賈第鞭毛蟲核糖體RNA小亞基基因序列，建立套式PCR檢測方法。應(yīng)用該技術(shù)，作者對馬來西亞某地區(qū)已通過三色染色法確定賈第鞭毛蟲糞便包囊進行基因分型研究。通過測序技術(shù)和進化樹的繪制及分析，準確鑒定出了當?shù)刭Z第鞭毛蟲流行的蟲株基因型（B型）。

4.3.3 逆轉(zhuǎn)錄-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）是對RNA病毒進行快速檢測的一種最常用的分子診斷技術(shù)。提取細胞或組織總RNA后在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，PCR擴增cDNA基因便能達到檢測病原微生物的目的。該技術(shù)也被應(yīng)用到對賈第鞭毛蟲的檢測。通常，對賈第鞭毛蟲的PCR檢測都針對染色體DNA進行，但PCR的缺點是不能提供病原體的活性和感染性。由于染色體DNA在卵囊死后仍可能在較長時間內(nèi)保存完好，普通PCR往往能檢出無感染活性的卵囊。由于mRNA的半衰期非常短（幾秒鐘），與以DNA為基礎(chǔ)的其他檢測方法相比，mRNA更能準確的反映機體的活性狀態(tài)。因為只有活性的細胞才能產(chǎn)生mRNA，所以針對賈第鞭毛蟲的RT-PCR檢測技術(shù)正是基于檢測編碼熱激蛋白Hsp70（heat shock protein 70）的 mRNA來檢測具有感染活性的卵囊。該方法通過熱激賈第鞭毛蟲卵囊，誘導其產(chǎn)生保護性的熱激蛋白mRNA，隨后立即抽提mRNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，用PCR擴增DNA產(chǎn)物，達到檢測的目的。Lee G C等［12］根據(jù)賈第鞭毛蟲基因序列和生物信息學分析設(shè)計Hsp70引物，利用RT-PCR方法擴增賈第鞭毛蟲熱激蛋白70基因，以區(qū)別賈第鞭毛蟲包囊的死活。研究表明，該技術(shù)靈敏度極高，在對包囊進行熱處理（45℃，20min）后，可檢測到1個活包囊／100μL。由此可見，該技術(shù)在賈第鞭毛蟲卵囊活性檢測中的巧妙應(yīng)用，打破了RT-PCR技術(shù)在寄生蟲領(lǐng)域的應(yīng)用瓶頸，為該技術(shù)在生物領(lǐng)域的廣泛使用開辟了新途徑，新思路。

4.3.4 實時熒光定量PCR（Real-time PCR） 實時熒光定量PCR技術(shù)是一種被生物科技工作者廣泛使用的分子檢測技術(shù)。該技術(shù)的發(fā)明歸功于兩個重要的發(fā)現(xiàn)：一是發(fā)現(xiàn)DNA Taq酶有從5′到3′外切酶活性，二是利用熒光能量傳遞技術(shù)構(gòu)建了雙標記寡核苷酸探針，即TaqMan探針。在PCR過程中，這些熒光信號可以被探測器所“即時”捕獲。該方法的特異性由引物和探針的特異性所決定，只有在PCR過程中，探針退火到目標片段才能發(fā)出熒光信號。國外很多學者等將熒光探針檢測技術(shù)與RTPCR技術(shù)相結(jié)合，建立了實時熒光定量RT-PCR技術(shù)，使得對賈第鞭毛蟲的檢測的靈敏性遠遠高于常規(guī)顯微鏡檢測方法。

Bruijnesteijn van Coppenraet L E 等［13］應(yīng)用實時熒光定量PCR方法對單次收集的糞便樣本進行阿米巴蟲，賈第鞭毛蟲，隱孢子蟲的多重聯(lián)合檢測，同時與分三次連續(xù)收集糞便樣品進行顯微鏡檢測結(jié)果進行比對 。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，在397份患者的糞便樣本中檢出152例（38.3%）陽性病例，其中18個樣本為雙重感染。應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測方法使得臨床檢出率提高了18%，而且結(jié)果證明，在臨床試驗中一個單一的糞便樣本就可滿足完整的寄生蟲學的診斷。無獨有偶，Ten Hove R J等［14］也曾對人糞便樣本進行溶組織阿米巴，賈第鞭毛蟲，隱孢子蟲和糞類圓線蟲的感染情況進行檢測分析和評估，并將日常檢測使用的顯微鏡檢和抗原檢測結(jié)果與建立的多重實時熒光定量PCR檢測結(jié)果進行比對。結(jié)果顯示，多重實時熒光定量PCR方法對溶組織阿米巴、賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲和糞類圓線蟲的檢出率大大提高。Calderaro A等［15］對2006年-2008年收集386個患者的771份糞樣本進行常規(guī)檢查和實時熒光定量PCR檢測，并對其敏感性和特異性進行了評估。結(jié)果表明，實時熒光定量PCR方法檢出了195份陽性樣本，比常規(guī)顯微鏡檢查（金標方法）多26份陽性，其靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值均為100%。Helmy M M等［10］對收集的97份人糞樣本進行賈第鞭毛蟲的實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示，41份樣本為陽性（42.3%），敏感性極高。由此可見，實時熒光定量PCR方法是一種非常敏感、高效、實用的快速檢測技術(shù)，它不僅可完成高通量的檢測，同時也大大降低了傳統(tǒng)檢測方法的工作量。

4.3.5 多重Real-time PCR 將幾對引物集聚在同一個PCR反應(yīng)體系內(nèi)，同時對指定樣本進行擴增，達到一步法檢測不同種類的寄生蟲或同一種類寄生蟲的不同基因型的目標，這一技術(shù)稱為多重PCR。

賈第鞭毛蟲、溶組織阿米巴蟲和隱孢子蟲是3種最重要的導致腹瀉的寄生原蟲。多年來，顯微鏡檢查糞便樣本被認為是溶組織阿米巴、賈第鞭毛蟲和隱孢子感染診斷的“金標準”，雖然PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗和直接熒光抗體檢測方法已被引入三種寄生蟲感染的診斷，但以上相對獨立的檢測方法用于對每一種寄生蟲檢測，合計起來費時、花費高、消耗大。應(yīng)用多重PCR技術(shù)則可有效解決以上問題。Haque R等［16］建立了多重Real-time PCR，在同一個PCR反應(yīng)體系中采用種特異性探針分別對溶組織阿米巴、賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲進行實驗室鑒別檢測，并將建立的方法在臨床標本進行評價。結(jié)果表明，該方法具有相當高的敏感性（89%）和特異性（99%）。該方法不僅可對以上3種寄生原蟲進行一步法檢測，同時該方法也可單獨用于檢測某種寄生蟲。Ten Hove R J等［14］利用多重 Real-time PCR技術(shù)檢測了2 591份糞便中的阿米巴、賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲和類圓線蟲，與傳統(tǒng)鏡檢檢測方法進行比較，敏感性明顯提高。

不僅如此，應(yīng)用多重Real-time PCR技術(shù)還可對賈第鞭毛蟲的基因型進行分型檢測研究。Eligio-Garcia L等［17］利用多重Real-time PCR對24份已知的賈第鞭毛蟲陽性糞便樣本進行分型基因檢測。結(jié)果顯示，18份為A1型，4份為A2型，1份為A1和A2混合型感染，1份為G型。多重Real-time PCR方法的應(yīng)用，不僅方便快捷，而且省時間、低消耗，未來的臨床應(yīng)用前景非常廣闊。

4.3.6 PCR-限制性片段多態(tài)性分析 PCR-限制性片段多態(tài)性分析（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）是一種通過設(shè)計保守引物，PCR擴增某些基因片段，然后用特定的限制性內(nèi)切酶酶切，觀察其酶切片段差異，進而準確鑒定不同種或不同基因型的現(xiàn)代分子技術(shù)。Helmy M M等［10］采用套式熒光PCR-RFLP技術(shù)對發(fā)生急性腹瀉人群的糞便樣本進行賈第鞭毛蟲的磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）基因分析。該方法成功揭示了當?shù)匕l(fā)生腹瀉人群受賈第鞭毛蟲感染嚴重，并對賈第鞭毛蟲的基因型進行了鑒別。該技術(shù)不僅能從新鮮糞便樣本中檢測到賈第鞭毛蟲，而且指出當?shù)亓餍械幕蛐图白钜赘腥巳旱哪挲g。Ajjampur S S等［18］對南印度地區(qū)城市貧民窟居民的發(fā)生急性腹瀉的兒童進行賈第鞭毛蟲感染調(diào)查，并對50份有腹瀉癥狀兒童的陽性糞樣和51份無癥狀的兒童陽性糞樣進行磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的PCR-RFLP分析。結(jié)果顯示50份有腹瀉癥狀的兒童的陽性糞便中，40份基因型為B型，5份為A2型，5份為B和A2混合感染；51份無癥狀的兒童陽性糞樣中，48份基因型為B型，2份集聚體A2型，1份為B型和A2型混合感染。由于PCR-RFLP方法快速簡便、成本較低，而且對樣品的純度要求不高，因此具有獨特的應(yīng)用價值和前景。

4.3.7 環(huán)介導等溫擴增技術(shù) 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）是一種非常簡潔和方便的基因擴增方法。通過該技術(shù)能實現(xiàn)在15min～60min內(nèi)，將目標基因擴增109～1010倍，這是所有其他基因擴增方法無法比擬的。也正是因為LAMP方法靈敏度極高，能實現(xiàn)樣品前處理簡單化的目標。如此高效率地擴增，產(chǎn)物量多到我們直接肉眼就能鑒別結(jié)果（反應(yīng)中產(chǎn)生大量焦磷酸鎂，可以肉眼判斷結(jié)果），省去了其他基因擴增方法后續(xù)結(jié)果檢測的步驟。該技術(shù)依賴于能夠識別靶序列上6個特異區(qū)域的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、快速、特異地擴增靶序列。國外學者Plutzer J等［19］首次將LAMP技術(shù)應(yīng)用到對賈第鞭毛蟲的檢測，并對該技術(shù)與傳統(tǒng)的PCR檢測技術(shù)進行比對。作者利用LAMP技術(shù)對35份糞便和水樣品進行檢測，其中檢出陽性樣本24份，比常規(guī)PCR檢出陽性樣本多1份；LAMP的特異性試驗結(jié)果顯示，該方法能特異擴增賈第鞭毛蟲集聚體A和B 2個基因型，而不能擴增其他寄生蟲。與PCR和Real-time PCR方法相比，LAMP是一種重復(fù)性好、靈敏性高、特異性強、經(jīng)濟省錢的賈第鞭毛蟲快速檢測方法。Plutzer J等［20］應(yīng)用LAMP方法并借助PCR測序技術(shù)，對2008年2月至3月期間匈牙利特定區(qū)域內(nèi)132只水鳥的糞便樣本進行賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的檢測，結(jié)果表明，在自然環(huán)境中，水鳥在隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的散播和區(qū)域性流行中起到一定的作用。我國學者盧濰媛等［21］根據(jù)GenBank賈第鞭毛蟲基因序列及環(huán)介導等溫擴增技術(shù)的原理，設(shè)計4條賈第鞭毛蟲特異引物，利用LAMP檢測藍氏賈第鞭毛蟲DNA。LAMP產(chǎn)物經(jīng)SYBR green I顯色反應(yīng)，對LAMP產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果成功檢測到體外培養(yǎng)的藍氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體。雖然LAMP法引物設(shè)計比較復(fù)雜，但與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，該方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便快速、不需要復(fù)雜儀器設(shè)備等優(yōu)點，因此為臨床檢測賈第鞭毛蟲提供了一種快速、簡便的新方法 。

5 結(jié)語

綜上所述，賈第鞭毛蟲病為人體腸道感染的最常見寄生蟲病之一，常常引起腹瀉、腹痛和消化不良，對人體健康的危害嚴重。賈第鞭毛蟲的檢測技術(shù)多樣，但各有優(yōu)缺點。用顯微鏡對人的糞便進行鏡檢已經(jīng)成為診斷賈第鞭毛蟲的“金標準”。然而，當用該法對糞便樣本進行顯微鏡鏡檢時費時費力，勞動強度大，檢出率低，敏感性不高。免疫學檢測法雖然大大提高了敏感性，但它對抗原要求較高，且很難區(qū)分包囊的活性。

現(xiàn)代分子生物學檢測技術(shù)以其敏感性好、特異性強、準確性高、檢測過程耗時短等眾多優(yōu)點越來越受到青睞，基因的分子檢測也將賈第鞭毛蟲的檢測技術(shù)提高到了新的臺階。分子生物學檢測方法的建立極大地大縮短了賈第鞭毛蟲檢測時間，也逐漸被越來越多的科研人員應(yīng)用和改進。PCR及其衍生技術(shù)的應(yīng)用極大地提高了賈第鞭毛蟲的檢出率，尤其是Real-time PCR方法敏感性極高，分子生物學檢測技術(shù)已成為當前所有賈第鞭毛蟲檢測技術(shù)當中最快速、最敏感的方法之一，具有很好的發(fā)展前景。

然而，在實際檢測過程中，盡管由于賈第鞭毛蟲DNA交叉污染的情況出現(xiàn)，但相比而言它的特異性仍然較低，很多陽性樣本無法檢出。因此，在實際工作中，對糞便樣本進行賈第鞭毛蟲檢驗和鑒定，顯微鏡檢查仍是首選，這主要是因為它能夠同時檢測除賈第鞭毛蟲以外的其他胃腸道寄生蟲。實時熒光定量PCR以及LAMP技術(shù)因具有較高的敏感性，因而常用于顯微鏡檢查的替代方法，或大量樣本檢測的初篩工具，在實際檢測中應(yīng)用非常廣泛。我們有理由相信，隨著免疫學和分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，賈第鞭毛蟲的檢測方法也會越來越完善，以便將賈第鞭毛蟲的危害降到最低。

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