致病性大腸埃希菌HPI研究進展

臧雅婷，嚴玉霖，高 洪，高利波，趙 汝，李祥峰，邵志勇，盧 琴，崔艷艷

（云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明650201）

強毒力島 （high-pathogeniticity island，HPI），首次發(fā)現(xiàn)于耶爾森菌屬，所以始稱耶爾森菌強毒力島，HPI主要含有與鐵攝取有關的毒力基因簇，編碼參與合成及攝取鐵載體耶爾森菌素（yersiniabactin）的鐵抑制蛋白 （iron-repressible protein，irp）基因及其調控基因，行使鐵攝取功能。它是賦予耶爾森菌致病性和毒力的重要因素，介導著感染過程。但HPI也在其他腸桿菌科細菌中發(fā)現(xiàn)，如致病性大腸埃希菌、枸櫞酸桿菌、沙門菌、克雷伯菌等。本文就致病性大腸埃希菌HPI的研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 基本特征

HPI首先在耶爾森菌屬中發(fā)現(xiàn)，具有毒力島的基本特征：①載有致病性大腸埃希菌毒力相關性的編碼基因；②僅存在于強毒株，如腸外致病性大腸埃希菌；③G＋C mol%與大腸埃希菌染色體有明顯差異（一般高于）；④片段約為102kb，主要的結構基因有irp1、irp2和fyuA，其中irp2是HPI的標志基因［1］；⑤為一緊密、明確的遺傳學單位；⑥一側外緣與asn tRNA基因相連；⑦載有“可移動”的基因及整合酶基因。

據(jù)其基本特征，對大腸埃希菌的分子生物學鑒定方法如下：成功提取大腸埃希菌的基因組DNA，應用特異性引物（irp2或者fyuA），以大腸埃希菌基因組DNA為模板，PCR法擴增出特異條帶后，大小與預期結果基本一致，表明成功擴增并檢測到大腸埃希菌的irp2基因和fyuA基因，可判定為HPI［2］。

2 流行病學特征

HPI是在耶爾森菌屬中首先發(fā)現(xiàn)，隨后發(fā)現(xiàn)在克雷伯菌和枸櫞酸桿菌等腸道菌群中存在。在93% 的黏附集聚性大腸埃希菌（EAEC），80% 的分離自血液標本的大腸埃希菌、產(chǎn)志賀毒素的非O157大腸埃希菌和尿道致病大腸埃希菌，以及30% 的非致病大腸埃希菌中都具有irp2-fyuA 基因簇［3］。irp2-irp1-irp3-irp4-irp5-fyuA基因簇簡稱fyuA-irp2基因簇，被認為是參與由鐵載體耶爾森菌素介導的鐵攝取功能的主要基因成分，fyuA基因編碼產(chǎn)物是一個具有雙重受體功能分子質量為73.7ku的鐵抑制外膜蛋白，被稱作含鐵耶爾森菌素吸收毒力基因［4］。通過測序發(fā)現(xiàn)，腸聚集性大腸埃希菌與小腸結腸炎耶爾森菌（Yen）、鼠疫耶爾森菌（Ype）和假結核耶爾森菌（Yps）的irp2和fyuA基因約有99%的同源性；腸聚集性大腸埃希菌與Yps的fyuA基因由于核苷酸替代作用導致氨基酸錯配，但兩者G＋C mol%相近；因而推斷irp2-fyuA基因簇可以在腸道細菌間水平轉移。姜桂香等［5］在2000年分離到10株帶有irp2基因的菌株，并提醒攜帶此基因的大腸埃希菌對人類健康的威脅應該引起重視。在不到10年的時間內(nèi)，該毒力基因已迅速擴散，造成的危害不容忽視。

通過致病性細菌的水平基因轉移及染色體的重構，特殊大腸埃希菌菌株能夠獲得毒力基因，并且能夠導致人及動物的廣泛的腸內(nèi)及腸外感染［6-7］。腸內(nèi)致病性大腸埃希菌主要導致人及動物腹瀉，在西南戰(zhàn)區(qū)腹瀉患者1 352例腹瀉病人中檢出36個屬種594株病原菌，檢出36株攜帶耶爾森菌HPI irp2基因大腸埃希菌，檢出率為2.66%［8］。腸外致病性大腸埃希菌引起人及家養(yǎng)動物的不同種類的感染［9-10］，禽致病性大腸埃希菌主要引起氣囊炎、心包炎、敗血癥等；可導致家畜慢性乳腺感染，在豬和牛中，大部分導致新生兒敗血癥及泌尿道感染［11］。

近年來，在許多疾病中，致病性大腸埃希菌HPI毒力因子可能影響著疾病的進程。如嬰兒猝死綜合征（Sudden infant death syndrome，SIDS），與毒血癥發(fā)病機理相似，其感染的關鍵機制可能與大腸埃希菌的參與有關。試驗證明，攜帶有irp2基因的大腸埃希菌在SIDS嬰兒中具有很高的比例。遺傳因素影響著大腸埃希菌與宿主之間的相互作用，因此，HPI可能是引起SIDS多重因素之一［12］。再如，在深受免疫抑制患者例如移植接受患者中引起菌血癥的大腸埃希菌菌株，大部分流行毒力基因為fyuA（yersiniabactin system：70%）和iutA （aerobactin system：63%）。試驗發(fā)現(xiàn)，致病性大腸埃希菌HPI毒力因子fyuA可以解釋腹部源菌血癥患者處于免疫功能低下狀態(tài)，且該原因占據(jù)主導地位［13］。

綜上所述，致病性大腸埃希菌HPI的相關基因在不同的疾病過程中起到非常重要的作用，在疾病的流行中，相關毒力因子會通過各種形式影響著疾病的進程。HPI在我國養(yǎng)殖場大腸埃希菌中普遍存在，大腸埃希菌是一種重要的人獸共患病病原，動物源大腸埃希菌常常通過食物鏈等途徑對環(huán)境及人類健康造成嚴重的危害。HPI毒力島可通過質粒水平傳播到另一株細菌的特性，使得這些毒力因子有可能在各種菌株、動物和人類之間互相傳播，且HPI已廣泛地分布于人的致病性腸桿菌中，對腸道外感染發(fā)揮重要作用［14］，這將對人類的健康和公共衛(wèi)生安全帶來很大的問題和威脅。大腸埃希菌感染成為影響我國養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重大細菌病之一，給養(yǎng)殖業(yè)帶來的經(jīng)濟損失越來越嚴重。

3 HPI的獲得機理

細菌的多樣性，是由不同的遺傳機制引起的，包括點突變，基因重組和基因水平轉移（horizontal gene transfer，HGT），所有這些都代表細菌進化的推動力量。點突變和基因重組不會創(chuàng)造新的遺傳因素，只是導致緩慢的進化發(fā)展，而HGT可產(chǎn)生動態(tài)的基因組，其中大量的DNA被引入，并從染色體中刪除。因此，HGT能夠有效改變細菌種類的生活方式。對于細菌病原體，毒力與水平轉移獲取的毒力決定因素有關，細菌毒力的進化可能被視作一個能夠致病的適應過程。

目前，雖然HPI獲得的機制尚不清楚，但HPI具有的整合模型特征支持了其通過位點特異性重組獲得的假設。簡單的說，在整合酶的作用下，質粒、噬菌體等可流動的DNA成分參與毒力島序列向目標位點的整合。通過位點特定重組，噬菌體整合到目標DNA黏附位點。tRNA基因的3′端常作為黏附位點，因為tRNA在菌種間高度保守且常呈過剩存在，整合到tRNA基因的3′端仍可保持tRNA基因的功能。整合機制的結果是，插入DNA序列的兩端有重復序列形成，并且整合酶基因插入到與tRNA插入位點臨近的位置，但轉錄方向與tRNA相反。這些特點HPI均具備［15］。

雖然毒力島的確切來源尚無明確定論，但其典型的結構特征和廣泛的水平分布都支持了毒力島基因水平轉移獲得的假設。在Schuber T等［16］將HPI作為模型來研究毒力島轉移機制，利用多位點序列分析（MLST）的方法，建立系統(tǒng)進化樹，研究HPI在大腸埃希菌基因中的分布，此研究證明了HPI是與供體菌株HPI側面DNA區(qū)域一起被轉移整合的，第一次表明了可接合轉移和同源DNA重組在大腸埃希菌HPI的水平轉移中起著重要作用?；驆u的水平轉移是導致毒力島在致病菌中呈現(xiàn)鑲嵌模式的可能原因，是新的病原菌產(chǎn)生的重要機理之一。盧珊等［17］研究發(fā)現(xiàn)，攜帶HPI的大腸埃希菌同時還攜帶部分O島和其他毒力島成分，為這一學說提供了支持性證據(jù)。

綜合起來，毒力島的水平轉移在細菌進化過程中扮演重要角色，它可能與新發(fā)現(xiàn)的病原菌及細菌的毒力進化有關。

4 HPI與致病性的關系

致病性大腸埃希菌是導致許多畜禽傳染病的原因，如家禽氣囊炎，豬和奶牛的急性乳腺炎，新生兒敗血癥，尿路感染。在它們的動物宿主中，致病性大腸埃希菌不得不與低效的鐵競爭。致病性大腸埃希菌菌株通過利用不同的策略能夠重新獲得分離于宿主蛋白的鐵，以增加細菌的致病性。這些策略之一是利用鐵載體，小的分泌分子具有對鐵高吸引力。而鐵載體合成的基因簇又與HPI某些基因簇有一定聯(lián)系。致病性大腸埃希菌能夠合成不同類型的鐵載體，如腸菌素，耶爾森菌素［18］。

鐵在先天免疫系統(tǒng)中扮演著重要的角色。除了為數(shù)不多的游離鐵，在哺乳動物中大部分的鐵發(fā)現(xiàn)于包含入復雜分子中，如血紅素，或者結合于轉鐵蛋白及乳鐵蛋白。通過鐵載體獲取鐵的步驟包括鐵載體在細胞之中合成、鐵載體分泌、鐵-鐵載體反應、鐵-鐵載體細胞內(nèi)攝作用、鐵在細胞之中釋放［19］。大腸埃希菌利用鐵載體提供的額外的鐵，使自身毒力增強，同時使細菌的致病性增強。雖然大腸埃希菌HPI使細菌增強的機理還未準確闡明，但Paauw A等［20］在耶爾森菌素降低先天免疫細胞的氧化應激的研究中，通過對HPI編碼的鐵載體的研究，證明含HPI的耶爾森菌毒力更強?？梢酝茰y，大腸埃希菌的HPI基因簇很可能具有與鼠疫耶爾森菌相同的功能，而鼠疫耶爾森菌的HPI可以合成鐵攝取系統(tǒng)有關的耶爾森菌素［21］。從HPI轉移機制和細菌的分化角度來推測，大腸埃希菌很可能基于某種選擇壓力先獲得完整的HPI，在分化成各種菌的不斷進化過程中發(fā)生結構上的缺失，使得其功能失活，但在進化過程中對環(huán)境的適應性改變?nèi)阅苁辜毦旧砩嫦聛?。水平轉移的復雜過程也可能是造成其相對不完整性的一種可能的解釋。

每個鐵載體具有特殊的性能，可以被不同的因素所調節(jié)，提供不同的優(yōu)勢，允許致病性大腸埃希菌適應不同環(huán)境條件或者去克服宿主先天免疫。由鐵載體獲取鐵在致病性大腸埃希菌毒力方面起著重要作用，因為它需要外膜受體，對于疫苗的發(fā)展構成了重要的方向，這個疫苗可能被用來限制一定數(shù)量家畜由于致病性大腸埃希菌感染的傳染病。

5 小結及展望

致病性大腸埃希菌的HPI具有耶爾森菌HPI功能，編碼鼠疫菌素和耶爾森菌素雙受體功能FyuA蛋白以及特殊攝鐵系統(tǒng)；但耶爾森菌素FyuA受體僅在一部分HPI陽性菌株中表達，而且大多數(shù)FyuA-HMWP陽性株對鼠疫菌素并不敏感。這可能是大腸埃希菌中fyuA基因的部分缺失或點突變以及其它原因，如轉譯后，F(xiàn)yuA蛋白的修飾作用所致，也可能是由于耶爾森菌素攝鐵系統(tǒng)并不是擁有強毒力島HPI最重要的優(yōu)勢。HPI缺失會單獨影響fyuA基因表達，但關于fyuA基因表達不同的原因仍不明確，這也是HPI要重點研究的內(nèi)容之一。

另外，雖然已有研究表明通過水平轉移可使HPI轉移至大腸埃希菌及其種屬中，但是其轉移機制的細節(jié)及其在種屬間的分布仍然不很透徹。致病性大腸埃希菌HPI所導致疾病的主要毒力基因及其機制，以及該基因在不同動物中所致疾病的種類，這些都是有待于進一步研究和探討的問題。相信隨著人們對致病性大腸埃希菌HPI研究的不斷深入，這些問題將逐步被解決，人們對其認識也將更加清晰。

［1］ Koczura R，Kaznowski A.Occurrence of the Yersinia highpathogenicity island and iron up take systems in clinical isolates of Klebsiel lapneumoniae［J］.Microbial Pat Hogenesis，2003，35（5）：197-202.

［2］ 徐繼英，楊志強.奶牛乳腺炎源大腸埃希菌中耶爾森菌強毒力島相關基因的檢測及序列分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2012，45（6）：1199-1205.

［3］ Buchrieser C，Rusniok C，F(xiàn)rangeul L，et a1.The 102-kilobase pgm locus of Yersinia pestis：sequence analysis and comparison of selected regions among different Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis strains［J］.Infect Immun，1999，67：4851-4861.

［4］ Lv H，Henderson J P.Yersinia high pathogenicity island genes modify the Escherichia coli primary metabolome independently of siderophore production［J］.J Proteome Res，2011，10（12）：5547-5554.

［5］ 姜桂香，張守平，董 雪，等.從動物中分離到攜帶耶爾森氏菌HPI毒力島的大腸桿菌［J］.疾病監(jiān)測，2000，15（2）：50-52.

［6］ Dozois C M.Pathogenic diversity of Escherichia coli and the emergence of exotic islands in the gene stream［J］.Vet Res，1999，30：157-179.

［7］ Ron E Z.Distribution and evolution of virulence factors in septicemic Escherichia coli［J］.Int J Med Microbiol，2010，300：367-370.

［8］ 李剛山，王意銀.西南戰(zhàn)區(qū)腹瀉患者攜帶耶爾森菌HPI毒力島大腸艾希菌調查［J］.中國熱帶醫(yī)學，2011，11（11）：1305.

［9］ Johnson J R，Russo T A.Extraintestinal pathogenic Escherichia coli：the other bad E.coli［J］.J Lab Clin Med，2002，139：155-162.

［10］ Kaper J B，Nataro J P，Mobley H L.Pathogenic Escherichia coli［J］.Nat Rev Microbiol，2004，2：123-140.

［11］ Lutful Kabir S M.Avian colibacillosis and salmonellosis：a closer look at epidemiology，pathogenesis，diagnosis，control and public health concerns ［J］.Int J Environ Res Public Health，2010，7：89-114.

［12］ Highet A R，Berry A M，Bettelheim K A，et al.The frequency of molecular detection of virulence genes encoding cytolysin A，high-pathogenicity island and cyto lethal distending toxin of Escherichia coli in cases of sudden infant death syndrome does not differ from that in other infant deaths and healthy infants［J］.J Med Microbiol，2009，58（Pt 3）：285-289.

［13］ Bert F，Huynh B，Dondero F.Molecular epidemiology of Escherichia coli bacteremia in liver transplant recipients［J］.Transpl Infect Dis，2011，13（4）：359-365.

［14］ Koczura R，Mokracka J，Kaznowski A.The Yersinia highpathogenicity island in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolated from polymicrobial infections［J］.Pol J Microbiol，2012，61（1）：71-73.

［15］ 胡 靜.耶爾森菌強毒力島的水平轉移機制［J］.國外醫(yī)學：流行病學傳染病學分冊，2002，29（3）：167-170.

［16］ Schuber T，Darlu P.Role of intraspecies recombination in the spread of pathogenicity islands within the Escherichia coli species［J］.PLoS Pathog 2009，5（1）：e1000257.

［17］ 盧 珊，任志鴻.攜帶HPI毒力島的大腸桿菌的毒力基因分析［J］.中國人獸共患病學報，2007，23（7）：639.

［18］ Miethke M，Marahiel M A.Siderophore-based iron acquisi-tion and pathogen control［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2007，71，413-451.

［19］ Garenaux A，Caza M，Dozois C M，et al.The ins and outs of siderophore mediated iron uptake by extra-intestinal pathogenic Escherichia coli［J］.Vet Microbiol，2011，153：89-98.

［20］ Paauw A.Yersiniabactin reduces the respiratory oxidative stress response of innate immune cells ［J］.PLoS ONE，2009，4（12）：e8240.

［21］ Miller M C，F(xiàn)etherston J D，et al.Reduced synthesis of the Ybt siderophore or production of aberrant Ybt-like molecules activates transcription of yersiniabactin genes in Yersinia pestis［J］.Microbiology，2010，156：2226-2238.