腦心肌炎病毒檢測方法研究進(jìn)展

張海霞，于國偉，馮玉萍

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學(xué)西部環(huán)境健康研究所，甘肅蘭州730030；3.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730030）

豬腦心肌炎（Encephalomyocarditis，EMC）是由腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）引起的一種自然疫源性人獸共患傳染病。EMCV主要引起腦炎、心肌炎或心肌周圍炎以及母豬的繁殖障礙。EMCV最早于1945年從美國佛羅里達(dá)州一只患急性心肌炎死亡的黑猩猩體內(nèi)分離得到，并于1960年在巴拿馬確診為豬的致死性疾病病原體［1］。隨后該病在多個(gè)國家暴發(fā)和流行［2］。我國于2005年首次從病死仔豬和流產(chǎn)胎兒中分離到EMCV［3］，血清學(xué)調(diào)查表明我國規(guī)?；i場已普遍感染EMCV［4］。EMCV 可感染的宿主動(dòng)物較多，例如豬、松鼠、大象、長頸鹿甚至蚊子等，其中豬是感染最普遍、最嚴(yán)重的動(dòng)物，而鼠類是EMCV的自然儲(chǔ)存宿主［5］。由于腦心肌炎會(huì)造成大量仔豬死亡、母豬產(chǎn)弱胎、死胎等，因此該病的發(fā)生與流行已嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

1 EMCV病原學(xué)

EMCV屬于微RNA病毒科心病毒屬成員，為單股正鏈RNA病毒，其基因組全長約7.8 kb，結(jié)構(gòu)為典型的5＇－UTR－（L）－4－3－4－3＇－UTR，即5＇非翻譯區(qū)（5＇－UTR）和3＇非翻譯區(qū)（3＇－UTR）中間連接1個(gè)引導(dǎo)蛋白（L蛋白）、4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）。VP1、VP2、VP3位于病毒粒子表面，VP4位于衣殼內(nèi)側(cè)并緊貼于VP1－VP2－VP3復(fù)合體，VP1－VP2－VP3－VP4復(fù)合體組成殼粒，殼粒以5－對稱軸首先形成五聚體，再由12個(gè)五聚體形成15，3，2構(gòu)型的20面體。其中VP1抗原性最強(qiáng)，為研究最多的結(jié)構(gòu)蛋白［6］，而3D基因則是最保守基因，遺傳精確性最高，常被用作病毒RNA檢測的目標(biāo)基因［7］。

2 EMCV檢測方法

最早建立的檢測EMCV較為經(jīng)典可靠的方法是病毒的分離鑒定，但是該方法需要進(jìn)行相應(yīng)敏感細(xì)胞的病毒接種，待病變之后進(jìn)行鑒定，因此較為耗時(shí)費(fèi)力，不適用于快速診斷［8］；之后由Vlemmas J等建立的免疫組織化學(xué)法雖然可檢測心臟、脾、胰腺等組織中的病原體，但是該法制備病理組織樣品比較麻煩、耗時(shí)；后來由Meng X J等建立的放射性探針原位雜交技術(shù)，既具放射污染性，又操作冗長。鑒于這些方法各自存在的缺陷，建立一種更為高效、省時(shí)、簡便的EMCV檢測方法迫在眉睫。EMCV RTPCR檢測方法的問世，為這一問題的解決提供了較好的途徑，該法具有簡便、快速、靈敏等特點(diǎn)［9］，成為實(shí)驗(yàn)室檢測EMCV最常用的方法。隨著對EMCV研究的深入，已經(jīng)建立了多種新的檢測方法，為豬腦心肌炎病的防控提供了科學(xué)依據(jù)。

2.1 EMCV血清學(xué)檢測

對于血清學(xué)檢測EMCV抗體常用的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、血凝抑制試驗(yàn)（HI）、免疫熒光抗體試驗(yàn)（IFA）、瓊脂糖免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）和病毒中和試驗(yàn)（VN），其中 VN 和ELISA最常用。VN是常用的特異性檢測方法，但操作過程繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。建立的ELISA方法多是基于EMCV結(jié)構(gòu)蛋白［10－11］，雖可大規(guī)模地檢測血清樣品，省時(shí)省力，但是該方法需要制備特異性抗原，且常常無法區(qū)分免疫與野毒感染產(chǎn)生的抗體；基于非結(jié)構(gòu)蛋白建立的ELISA方法則不僅適用于臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查，且有望可以區(qū)分疫苗免疫和野毒感染。

由于2C蛋白為EMCV的非結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒的復(fù)制，因此在病毒復(fù)制時(shí)才會(huì)產(chǎn)生該蛋白，并刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，鑒于此劉蘭亞等［12］通過重組2C蛋白為包被抗原，建立了檢測EMCV抗體的間接ELISA方法，經(jīng)驗(yàn)證該方法能特異性的檢出EMCV感染豬的血清2C抗體，與豬瘟病毒（CFSV）、偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV－2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等的抗血清沒有交叉反應(yīng)，且與血清中和試驗(yàn)符合率較高，為臨床腦心肌炎的早期診斷和流行病學(xué)研究提供了技術(shù)手段。

2.2 EMCV病原學(xué)檢測

通常用于EMCV病原學(xué)檢測的方法主要有病毒中和試驗(yàn)（VN）、免疫組化試驗(yàn)（IHC）、核酸原位雜交技術(shù)（ISH）、反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）等，其中最常用的便是 VN 和 RT－PCR［13］。但是VN、IHC及ISH的過程均較為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，EMCV RT－PCR的建立很好的解決了這個(gè)問題［14］。但是由于常規(guī)RT－PCR分反轉(zhuǎn)錄和cDNA擴(kuò)增兩個(gè)步驟進(jìn)行，因此操作繁瑣，且加大了污染機(jī)率。一步法RT－PCR則是在RT－PCR基礎(chǔ)上進(jìn)一步的改進(jìn)，該方法是在一個(gè)反應(yīng)體系中，同時(shí)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，從樣品RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增到電泳觀察的全部過程可在4 h內(nèi)完成，可精確、快捷地?cái)U(kuò)增出目的片段，既可節(jié)省時(shí)間，又減少操作步驟，適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。施開創(chuàng)等［15］根據(jù)EMCV的保守基因3D基因序列，設(shè)計(jì)合成相應(yīng)引物，建立了檢測EMCV的一步法RT－PCR，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，該方法可擴(kuò)增相應(yīng)特異目的條帶，而對FMDV、CFSV、PRRSV等檢測結(jié)果均為陰性，證明該方法只對EMCV特異，經(jīng)進(jìn)一步試驗(yàn)可知其敏感性可達(dá)到2TCID50，說明建立的方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，且通過臨床樣品檢測，證實(shí)了該方法的可靠性，可用于EMCV的臨床檢測及流行病學(xué)調(diào)查。

2.3 其他一些新型檢測EMCV方法的建立

由于上述建立的EMCV檢測方法各有其缺陷性，因此更為靈敏、快速的新型EMCV檢測方法相繼問世，如建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real－time PCR），該方法以敏感、特異、污染少、可定量等優(yōu)點(diǎn)著稱，克服了RT－PCR只能定性不能定量，容易污染而產(chǎn)生假陽性，需電泳觀察結(jié)果，溴化乙錠（EB）對人體有害等缺點(diǎn)。目前實(shí)驗(yàn)室常用于檢測EMCV的 Real－time PCR主要有 Taq Man探針法和SYBR GreenⅠ染料法［16］。其中SYBR GreenⅠ是一種雙鏈DNA結(jié)合染料，它結(jié)合到雙鏈DNA后，可以使其熒光強(qiáng)度增加1 000倍以上，而不摻入雙鏈中的染料分子不發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。施開創(chuàng)［17］等針對腦心肌炎病毒VP1基因序列設(shè)計(jì)合成相應(yīng)引物，建立的檢測EMCV核酸的SYBR GreenⅠReal－time PCR方法經(jīng)臨床樣品檢測等驗(yàn)證，證明該法靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于EMCV的病原檢測及定量分析。但是SYBR GreenⅠReal－time PCR也有其局限性，這是由于SYBR Green I容易非特異性地與所有雙股DNA結(jié)合，因此反應(yīng)體系中的引物二聚體、污染的基因組DNA以及其他非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物均會(huì)導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)。而Taq Man real－time PCR 的優(yōu)勢在于利用上、下游引物及與目的模板互補(bǔ)的探針使反應(yīng)的特異性具有雙重保證，克服了SYBR GreenⅠ Real－time PCR存在假陽性的缺陷，從而可以確保檢測結(jié)果的可靠性。

為探討EMCV感染后促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平，從分子水平對EMCV的致病機(jī)制進(jìn)行研究，陳宏備等［18］建立了檢測小鼠IL－1β、TNF－α和管家基因β－actin的Taq Man real－time PCR 檢測方法。結(jié)果表明，該方法線性關(guān)系很好，直線回歸方程系數(shù)高；特異性強(qiáng)，僅以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，加入特異性引物及探針才可檢測到熒光信號(hào)；重復(fù)性好，組內(nèi)及組間變異系數(shù)均小于2%。該方法的建立不僅從分子水平，同時(shí)利用小鼠作為動(dòng)物模型，為EMCV致病機(jī)制研究提供了必要的技術(shù)手段。施開創(chuàng)等［19］利用Taq Man探針法的優(yōu)勢，根據(jù)EMCV 3D基因的保守序列設(shè)計(jì)合成了相應(yīng)引物及探針，建立了檢測 EMCV 的 Taq Man real－time RT－PCR 方法，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見該方法敏感性較高，比普通PCR高出100倍；特異性強(qiáng)，只能檢測到以EMCV cDNA為模板的熒光信號(hào)，以其他病毒為DNA／cDNA為模板的熒光信號(hào)均檢測不到；臨床實(shí)驗(yàn)重復(fù)性、可靠性均較好。另外為探討EMCV感染后IL－6、iNOS基因的表達(dá)水平，施開創(chuàng)等［20］針對小鼠IL－6、iNOS及管家基因β－actin的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立的小鼠IL－6、iNOS和β－actin的Taq Man real－time熒光定量PCR方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，組內(nèi)組間的變異系數(shù)均小于2%，可用于小鼠IL－6、iNOS基因的檢測及定量分析。這些方法的建立為EMCV的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供一種更為特異、靈敏、快速的檢測方法，同時(shí)為EMCV臨床診斷及致病機(jī)理研究提供了有效技術(shù)平臺(tái)。

3 小結(jié)

由于腦心肌炎病已經(jīng)嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病疫情在世界許多地方均有發(fā)生與流行。因此，目前建立的各類EMCV檢測方法是有效預(yù)防和控制本病的重要技術(shù)。只有能做到快速檢測、精確診斷，及時(shí)控制傳染源，切斷傳播途徑，才能防止該病在豬群中的傳播與流行。針對EMCV結(jié)構(gòu)蛋白建立的ELISA方法適用于基層大批量樣品的檢測，但是不能區(qū)別疫苗免疫產(chǎn)生的抗體及野毒感染的抗體，因此限制了其廣泛的使用；real－time PCR方法則是目前常用于實(shí)驗(yàn)室最為準(zhǔn)確的檢測方法，具有敏感、快速及可定量等優(yōu)點(diǎn)，但是real－time PCR也有其局限性，如使用的儀器設(shè)備昂貴，只能適用于科研，不能在基層使用等，這些局限性限制了該法的大規(guī)模臨床應(yīng)用。建立一種有效的、能廣泛適用于科研及基層的EMCV檢測方法為腦心肌炎病的防控提供技術(shù)支持是新的發(fā)展方向。

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