牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)病二溫式PCR診斷方法的建立及初步應(yīng)用

王振寶，劉啟生，哈 森，何曉杰，劉緒斌，孟 茹，葉爾保勒，巴音查汗＊

（1.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆伊寧835000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；3.伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊寧835000）

牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)病是由環(huán)形泰勒蟲(chóng)（Theileria annulata）引起的一種蜱傳性血液原蟲(chóng)病。該病的傳播媒介為璃眼蜱屬的多種蜱［1］，是一種季節(jié)性很強(qiáng)的地方性流行病，多呈急性經(jīng)過(guò)，發(fā)病率和病死率高，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)寄生于黃牛、水牛、瘤牛、牦牛及犏牛的紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)。該病分布廣泛，主要流行于北美和大多數(shù)中亞及南非地區(qū)，我國(guó)的西北、華北和東北的一些省區(qū)也為多發(fā)區(qū)［2］。目前，對(duì)牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)病的診斷主要采用血液涂片檢查法、淋巴結(jié)穿刺檢查法、間接熒光抗體試驗(yàn)（IFAT）［3］、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）［4］、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）［5］等。血液涂片檢查法、淋巴結(jié)穿刺檢查法檢出率低，IFAT和ELISA方法可用于檢測(cè)牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)抗體，但其敏感性不足以檢出所有感染動(dòng)物，存在著交叉反應(yīng)現(xiàn)象。PCR方法和DNA探針技術(shù)是目前這些方法中特異性最強(qiáng)、敏感性最高的病原檢測(cè)手段，但國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。

二溫式聚合酶鏈反應(yīng)，即二溫式PCR，又稱雙溫PCR、或二溫度點(diǎn)法PCR和二溫度梯度PCR，是根據(jù)經(jīng)典PCR技術(shù)原理，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)PCR進(jìn)行改進(jìn)，將退火和延伸合并為一個(gè)溫度，比標(biāo)準(zhǔn)PCR的退火溫度高，提高了反應(yīng)的特異性，縮短了檢測(cè)時(shí)間［6］。Dodson L A等［7］首先在醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域提出并應(yīng)用，國(guó)內(nèi)最初由閻小君等［8］進(jìn)行了研究報(bào)道。近年該方法應(yīng)用比較廣泛，主要用于水產(chǎn)品、哺乳動(dòng)物、禽類及植物中病原菌的快速檢測(cè)。本研究根據(jù)PCR技術(shù)原理，建立了特異、敏感、簡(jiǎn)便的牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)病二溫式PCR快速診斷方法，并應(yīng)用該方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行了診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲(chóng)種及臨床樣品 牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)、牛瑟氏泰勒蟲(chóng)、牛伊氏錐蟲(chóng)樣品均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院家畜寄生蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室巴音查汗教授提供。臨床樣品采自牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)病流行地區(qū)的新疆昌吉回族自治州木壘縣、吐魯番托克遜縣和博爾塔拉蒙古族自治州達(dá)勒特鎮(zhèn)，共50份抗凝全血。

1.1.2 試劑 全血基因組提取試劑盒為北京百泰克公司產(chǎn)品；PCR試劑、氨芐青霉素（Amp）、胰蛋白胨、酵母提取物、X－gal、異丙基硫代－β－D 半乳糖苷（IPTG）為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、p MD 18－T 載體、限制性核酸內(nèi)切酶Bam HⅠ和Hin dⅢ為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒為愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖、溴化乙錠為Sigma公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；試驗(yàn)用水符合GB／T 6682中一級(jí)水規(guī)格；其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 PCR診斷方法的建立

1.2.1.1 模板DNA的制備 嚴(yán)格按照全血基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，置于－20℃保存。

1.2.1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù) GenBank（登錄號(hào)：Z48739）已發(fā)表的牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)裂殖子表面抗原（Tams1）基因序列，用Oligo 6.0軟件在保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

上 游 引 物：5′－TGCTGCCCAACCAAAGAT－3′；下游引物：5′－AGCGGAGGTGAACAAAGC－3′。

1.2.1.3 PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件的優(yōu)化 應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)方法，采用25μL反應(yīng)體系對(duì)影響PCR反應(yīng)的主要參數(shù)Mg2＋濃度、引物濃度和Tm值進(jìn)行了優(yōu)化。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定分析 將回收純化的PCR產(chǎn)物與p MD 18－T載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，在含氨芐青霉素、IPTG和X－gal的選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單個(gè)白色菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并用DNAStar分析軟件分析。

1.2.3 特異性試驗(yàn) 分別對(duì)牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)DNA、雙芽巴貝斯蟲(chóng)DNA、牛瑟氏泰勒蟲(chóng)DNA和牛伊氏錐蟲(chóng)DNA，采用優(yōu)化后的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.4 敏感性試驗(yàn) 對(duì)所提取的牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)DNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 OD 260 nm，計(jì)算DNA的濃度（原始濃度為34 ng／μL），對(duì)該模板進(jìn)行10倍倍比稀釋至10－8，采用優(yōu)化后的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行二溫式PCR擴(kuò)增，測(cè)定最低模板檢測(cè)量。

1.2.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)及臨床應(yīng)用試驗(yàn) 用同一批次提取的牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)DNA作為模板，進(jìn)行5次二溫式PCR擴(kuò)增，測(cè)定所建立的二溫式PCR方法的重復(fù)性；分別用不同批次提取的牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)DNA作為模板，進(jìn)行5次二溫式PCR擴(kuò)增，測(cè)定所建立的二溫式PCR方法的穩(wěn)定性。

1.2.6 兩種方法的對(duì)比試驗(yàn) 對(duì)從新疆牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)病流行地區(qū)采集的50份全血樣品分別進(jìn)行二溫式PCR和血涂片診斷，進(jìn)行結(jié)果分析，比較兩者陽(yáng)性檢出率。

2 結(jié)果

2.1 PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件的優(yōu)化

應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)方法優(yōu)化PCR反應(yīng)體系為：Mg2＋濃度1.5 mmol／L，d NTPs濃度0.2 mmol／L，引物濃度0.3 mmol／L，模板2μL，Taq DNA聚合酶濃度2.5 U／100μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25μL；最適反應(yīng)條件為：95℃5 min；95℃30 s，61℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g／L瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出大小為154 bp的電泳條帶，與目的片段相符，該反應(yīng)條件下條帶清晰，整齊，亮度高，無(wú)拖尾現(xiàn)象（圖1第9泳道）。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

將小量提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行二溫式PCR擴(kuò)增，得到一條與預(yù)期大小一致的特異性片段（154 bp）（圖2）。同時(shí)使用Bam HⅠ和Hin dⅢ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，切出了2 502 bp和190 bp的2個(gè)片段，與預(yù)期片段大小相符（圖3）。表明目的基因成功插入載體內(nèi)。

2.3 重組質(zhì)粒的序列測(cè)定與序列比對(duì)

將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，經(jīng)DNA Star軟件分析，基因序列與引物設(shè)計(jì)時(shí)所選（GenBank中登錄號(hào)為Z48739）片段的相似性為96%（圖4）。

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

將牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)DNA、牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)DNA、牛瑟氏泰勒蟲(chóng)DNA和牛伊氏錐蟲(chóng)DNA，分別進(jìn)行二溫式PCR擴(kuò)增，結(jié)果牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)DNA樣品能擴(kuò)增出大小約154 bp的明亮條帶，而其它樣品擴(kuò)增不出任何條帶（圖5），說(shuō)明所設(shè)計(jì)的牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)DNA的引物有較強(qiáng)的特異性。

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)模板DNA（濃度為34 ng／μL）進(jìn)行108倍稀釋時(shí)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，即該二溫式PCR最低能檢測(cè)到牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)DNA濃度為34 fg／μL（圖6）。

2.6 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)及臨床應(yīng)用試驗(yàn)

用同一批次提取和不同批次提取的牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)DNA作為模板，分別進(jìn)行5次二溫式PCR擴(kuò)增，均可擴(kuò)增出長(zhǎng)為154 bp的特異片段，表明重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。

圖4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果Fig.4 The sequencing results of PCR products

2.7 兩種方法的對(duì)比試驗(yàn)

對(duì)采自牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)病流行區(qū)的50份抗凝全血分別進(jìn)行了二溫式PCR和血涂片診斷。二溫式PCR的陽(yáng)性檢出率為88%，而血涂片的陽(yáng)性檢出率只有58%（表2），并且血涂片診斷為陽(yáng)性的樣品經(jīng)二溫式PCR診斷均為陽(yáng)性，表明二溫式PCR診斷方法比血涂片診斷方法更為敏感。

表2 二溫式PCR和血液涂片診斷結(jié)果Table2 The results of two－temperature PCR and blood smears

3 討論

均勻和正交設(shè)計(jì)可以解決多因素、多水平試驗(yàn)中的優(yōu)化問(wèn)題，與正交設(shè)計(jì)對(duì)比，均勻設(shè)計(jì)具有試驗(yàn)次數(shù)少、布點(diǎn)均勻、結(jié)果可靠、易學(xué)易用等特點(diǎn)，更適合于像PCR這樣多因素多水平實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選方案設(shè)計(jì)［9］。本文是采用均勻設(shè)計(jì)方法，進(jìn)行二溫式PCR反應(yīng)體系和循環(huán)條件的優(yōu)化，若運(yùn)用正交設(shè)計(jì)，試驗(yàn)處理組合數(shù)為162＝256，是均勻設(shè)計(jì)處理組合數(shù)16的水平數(shù)16倍，對(duì)于水平數(shù)高的多因素試驗(yàn)，應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)顯然可以事半功倍。

一般PCR儀的升溫速度為4℃／s，60℃到80℃的升溫時(shí)間約為5 s；Taq DNA聚合酶活性最佳溫度為72℃，此溫度下的延伸速度為150 bp／s～300 bp／s，60℃～70℃時(shí)約為60 bp／s～120 bp／s，對(duì)于相對(duì)較短的DNA片段（100 bp～200 bp），可將退火、延伸溫度合并為一個(gè)溫度，采用二溫式PCR能產(chǎn)生與三步PCR同樣多的產(chǎn)物。這可能是由于反應(yīng)混合物在變性溫度和退火溫度（94℃～50℃）之間過(guò)渡時(shí)，已達(dá)到了Taq DNA聚合酶的最佳反應(yīng)溫度（70℃～75℃），在這么短的時(shí)間內(nèi)與模板退火結(jié)合的引物已經(jīng)充分延伸形成產(chǎn)物片段。為了獲得高特異性而采用高退火－延伸溫度，范圍可以高于理論溫度5℃～10℃，達(dá)到60℃～70℃，最佳為68℃。因此，在設(shè)計(jì)引物時(shí)就要有意識(shí)的提高Tm值，使引物與模板能準(zhǔn)確結(jié)合而且穩(wěn)定性好，以減少非特異擴(kuò)增［6］。本文所擴(kuò)增的目的片段大小為154 bp，在進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，有意識(shí)的提高了退火溫度（Tm＝61℃）。

PCR具有良好的特異性，環(huán)形泰勒蟲(chóng)30 ku蛋白的基因序列具有良好保守區(qū)［10］。Kirvar E 等［11］采用編碼環(huán)形泰勒蟲(chóng)30 ku蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)帶蟲(chóng)牛和蜱體內(nèi)的環(huán)形泰勒蟲(chóng)感染狀況檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)該引物不僅敏感性良好，在帶蟲(chóng)牛的每微升血液中有1個(gè)蟲(chóng)體時(shí)即可檢出，同時(shí)該引物與水牛泰勒蟲(chóng)、小泰勒蟲(chóng)、雙芽巴貝斯蟲(chóng)、牛巴貝斯蟲(chóng)、分歧巴貝斯蟲(chóng)也無(wú)交叉反應(yīng)。本文亦采用編碼環(huán)形泰勒蟲(chóng)30 ku蛋白的基因（Tams1）序列設(shè)計(jì)引物，建立二溫式PCR，經(jīng)特異性試驗(yàn)表明該檢測(cè)方法對(duì)牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)、牛瑟氏泰勒蟲(chóng)、牛伊氏錐蟲(chóng)均無(wú)交叉反應(yīng)性；敏感性試驗(yàn)表明該檢測(cè)方法能檢測(cè)出牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)DNA的最低濃度為34 fg／μL。本試驗(yàn)建立的二溫式PCR檢測(cè)方法，以采自牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)病流行區(qū)的抗凝全血作為檢樣，檢測(cè)牛環(huán)形泰勒蟲(chóng)病陽(yáng)性率為88%（44／50），而血涂片的陽(yáng)性檢出率只有58%（29／50），其中血涂片檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品經(jīng)二溫式PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性，因此，二溫式PCR檢測(cè)方法比血涂片檢測(cè)方法更特異、更敏感，更適合于本病的臨床診斷、隱性感染和流行病學(xué)調(diào)查的研究。

［1］Branco A，Orvalho J，Alexandre L，et al.Fatal cases of Theileria annulata infection in calves in Portugal associated with neoplastic－like lymphoid cell proliferation［J］.J Vet Sci，2010，11（1）：27－34.

［2］黨志勝，羅建勛，殷 宏，等.環(huán)形泰勒蟲(chóng)病診斷技術(shù)的發(fā)展概況［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志，2004，34（1）：37－39.

［3］Pipano E，Cahana M.Fluorescent antibody test for the serodiagnosis of Theileria annulata［J］.J Parasitol，1969，55（4）：765.

［4］Gubbels M J，d＇Oliveira C，Jonqejan F.Development of an indirect Tams1 enzyme－linked immunosorbent assay for diagnosis of Theileria annulata infection in cattle［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2000，7（3）：404－411.

［5］Tavares R G，Staggemeier R，Borges A L P，et al.Molecular techniques for the study and diagnosis of parasite infection［J］.J Venomous Animals Toxins including Tropical Diseases，2011，17（3）：239－248.

［6］董 倩，黃國(guó)強(qiáng)，葉冰瑩，等.二溫式PCR在特異短核酸探針合成中的應(yīng)用［J］.花生學(xué)報(bào)，2008，37（3）：5－10.

［7］Dodson L A，Kant J A.Two－temperature PCR and heteroduplex detection：application to rapid cystic fibrosis screening［J］.Mol Cell Probes，1991，5（1）：21－25.

［8］閻小君，蘇成芝，吉昌華.一種快速微量的雙溫PCR法［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1992，19（6）：480－481.

［9］朱 濱，王囯荃，陳 堅(jiān).用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化apo E基因的PCR擴(kuò)增方案［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27（3）：311－315.

［10］藺紅玲，張繼瑜，魏小娟，等.環(huán)形泰勒蟲(chóng)主要膜蛋白的研究進(jìn)展［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（5）：22－24.

［11］Kirvar E，Ilhan T，Katzer F，et al.Detection of Theileria annulata in cattle and vector ticks by PCR using the Tams1 gene sequences［J］.Parasitology，2000，120：245－254.