不同冷凍保護(hù)劑和冷凍方法對(duì)小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞凍存效果的影響

肖 雄，鄧玉金，趙海龍，吳有博，李躍民

（西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶400715）

耳皮膚成纖維細(xì)胞因具有取材方便、易獲取、體外增殖能力強(qiáng)、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、較易進(jìn)行傳代培養(yǎng)和不易發(fā)生轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)，在體細(xì)胞核移植、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、治療性克隆和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞等研究領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。但是，體外培養(yǎng)的細(xì)胞，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞各種生物學(xué)特征會(huì)逐漸發(fā)生變化，同時(shí)，長(zhǎng)期傳代也會(huì)造成資源浪費(fèi)。因此，在細(xì)胞傳代過(guò)程中，需要適時(shí)進(jìn)行細(xì)胞冷凍保存，以保證體外培養(yǎng)細(xì)胞的質(zhì)量，又便于取用。液氮（－196℃）冷凍保存細(xì)胞，理論上是無(wú)限久的，但由于目前技術(shù)局限，凍存時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞復(fù)蘇后存活率越低。因此，細(xì)胞在不同凍存溫度、不同凍存方法和不同冷凍保護(hù)劑下凍存效率存在差異。本試驗(yàn)以DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，以二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）或甘油（glycerol，GL）作為冷凍保護(hù)劑，并添加胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）組成冷凍保護(hù)液，分別采用4種冷凍降溫方法，對(duì)體外培養(yǎng)的第3代小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存。通過(guò)比較不同處理組復(fù)蘇后細(xì)胞的存活率和培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞貼壁率，探討不同冷凍保存方法和冷凍保護(hù)劑對(duì)小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞解凍復(fù)蘇后細(xì)胞存活率和貼壁率的影響，并對(duì)適宜冷凍方法所得小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行研究，旨在篩選適宜的小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的冷凍保存體系，為小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞用于體細(xì)胞核移植和重編程為多能干細(xì)胞等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小鼠，8周齡～10周齡雌鼠，體重23 g～28 g，購(gòu)于重慶市中藥研究所動(dòng)物研究中心。

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM粉末，Gibco公司產(chǎn)品；DMSO，GL，胰蛋白酶，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）Sigma公司、杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品。

CO2培養(yǎng)箱（3111）Thermo Forma公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡（T－DH）Nikon Japan公司產(chǎn)品；超低溫冰箱（720）Thermo Electron Corporation公司產(chǎn)品；液氮罐（YDS－30B）成都液氮容器廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠耳皮膚組織的獲取 頸椎脫臼法處死小鼠，手術(shù)刀片剔除耳毛，經(jīng)酒精消毒，用無(wú)菌眼科剪剪取耳朵，稱重后，置于加有750 mL／L酒精的玻璃培養(yǎng)皿中浸泡、清洗30 s～40 s后取出，在含有青、鏈霉素的無(wú)Ca2＋、Mg2＋的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中清洗3遍后，將耳皮膚組織移入35 mm的玻璃培養(yǎng)皿中備用。

1.2.2 小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng) 將耳皮膚組織塊剪碎，用無(wú)Ca2＋、Mg2＋的PBS清洗，棄去上層懸浮組織，加入5 mL 2.5 g／L胰蛋白酶－EDTA，置于37℃的培養(yǎng)箱中消化30 min后取出，加5 mL含血清DMEM培養(yǎng)液終止消化，移液槍反復(fù)吹打，經(jīng)200目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾，取濾液于10 mL離心管中，以1 000 r／min離心10 min，棄上清液，再加無(wú)Ca2＋、Mg2＋的 PBS清洗、搖勻，重復(fù)離心（1 000 r／min，10 min），棄上清液。調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)／mL，接種于無(wú)菌的12.5 cm2培養(yǎng)瓶中，體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中，37℃并且飽和濕度條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)。

1.2.3 小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 當(dāng)小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)鋪滿瓶底，達(dá)到80%～90%時(shí)，采用1.25 g／L胰蛋白酶－EDTA消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.4 小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的凍存 當(dāng)培養(yǎng)的第3代小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)鋪滿瓶底，達(dá)到80%以上時(shí)，棄去培養(yǎng)液，無(wú) Ca2＋、Mg2＋的PBS清洗兩遍，加入1.25g／L胰蛋白酶－EDTA消化至大部分細(xì)胞變圓后，采用含血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞吹散后經(jīng)1000 r／min離心10 min，棄去上清液，收集細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)液，重復(fù)離心，將冷凍保護(hù)液重新懸浮細(xì)胞加入2 mL細(xì)胞凍存管中并標(biāo)記試驗(yàn)編號(hào)和日期等。

以100 mL／L FBS ＋ 100 mL／L DMSO ＋DMEM 或 100 mL／L FBS ＋ 100 mL／L GL ＋DMEM作為冷凍保護(hù)液，分別采用4種冷凍方法對(duì)體外培養(yǎng)第3代小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存（表1）。

表1 小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的冷凍方法設(shè)計(jì)Table1 Cryopreservation methods of mouse ear skin fibroblasts

1.2.5 細(xì)胞的復(fù)蘇 細(xì)胞經(jīng)液氮凍存1個(gè)月后，從液氮罐中取出凍存管，檢查是否有蓋子松動(dòng)（若蓋子松動(dòng)則棄去此樣品），迅速投入37℃恒溫水浴鍋中，并不斷搖動(dòng)凍存管使其迅速解凍。待完全溶化后取出凍存管，用750 mL／L酒精消毒。以完全培養(yǎng)液稀釋，將溶液轉(zhuǎn)至10 mL離心管內(nèi)，以1 000 r／min離心10 min，棄去上清液（冷凍保護(hù)液）以減少冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的毒性作用。

1.2.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞存活率的統(tǒng)計(jì) 將小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞懸液與4 g／L臺(tái)盼藍(lán)染液按4∶1的比例混勻，靜置2 min，采用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)細(xì)胞密度和細(xì)胞存活率，其中死細(xì)胞被染成藍(lán)色，而活細(xì)胞不著色。

細(xì)胞密度（細(xì)胞數(shù)／mL）＝（四大格的細(xì)胞數(shù)／4）×10 000×稀釋倍數(shù)

細(xì)胞存活率（%）＝［（細(xì)胞總數(shù)－死細(xì)胞數(shù)）／細(xì)胞總數(shù)］×100%

1.2.7 細(xì)胞貼壁率的統(tǒng)計(jì) 將解凍復(fù)蘇后的小鼠耳皮膚成纖維懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)為細(xì)胞濃度1，然后將細(xì)胞接種到12.5 m2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，48 h后吸棄培養(yǎng)液，無(wú)Ca2＋、Mg2＋的PBS清洗2遍～3遍后，采用1.25 g／L胰蛋白酶－EDTA消化已貼壁細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞密度計(jì)為細(xì)胞濃度2。

細(xì)胞貼壁率（%）＝（細(xì)胞濃度2／細(xì)胞濃度1）×100%。

細(xì)胞貼壁率＝（48 h后貼壁細(xì)胞濃度／接種細(xì)胞濃度）×100%

1.2.8 小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線繪制采用篩選所得適宜冷凍方法和冷凍保護(hù)劑進(jìn)行小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的冷凍保存。調(diào)整解凍復(fù)蘇后的第3代小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞接種濃度為5×104個(gè)／mL，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔滴加0.4 mL，即每孔的最初細(xì)胞總數(shù)約為2×104個(gè)，每2 d換液1次。從接種時(shí)間算起，每隔24 h用1.25 g／L胰蛋白酶－EDTA消化3孔細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，求其平均值，連續(xù)進(jìn)行7 d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞總數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 13.0軟件對(duì)小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的存活率和貼壁率進(jìn)行單因素方差分析（One－Way－ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 不同冷凍保存方法和冷凍保護(hù)劑對(duì)小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞冷凍－解凍后細(xì)胞存活情況的影響

不同冷凍保存方法和冷凍保護(hù)劑對(duì)小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞解凍復(fù)蘇后細(xì)胞存活情況的影響見(jiàn)表2。由表2可知，以100 mL／L DMSO作為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的冷凍保存時(shí)，方法3處理組的解凍復(fù)蘇后細(xì)胞存活率高于方法2（P＞0.05），極顯著高于方法1（P＜0.01）和方法4處理組（P＜0.01）。以100 mL／L GL作為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的冷凍保存時(shí)，方法3的解凍復(fù)蘇后細(xì)胞存活率高于方法2（P＞0.05），并分別極顯著高于方法1（P＜0.01）和方法4處理組（P＜0.01）。在相同方法的情況下，100 mL／L DMSO作為冷凍保護(hù)劑處理組的解凍復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率均分別高于100 mL／L GL處理組，并且在方法2中表現(xiàn)出極顯著的差異（P＜0.01）。因此，宜選用100 mL／L DMSO作為冷凍保護(hù)劑，采用方法3進(jìn)行冷凍保存可以獲得較高的小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞解凍復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率。

表2 不同冷凍保存方法和冷凍保護(hù)劑對(duì)小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞冷凍－解凍后細(xì)胞存活率（%）的影響Table2 Effect of different cryopreservation methods and cryoprotectants on survival rate（%）of mouse ear skin fibroblasts after being thawed

2.2 不同冷凍保存方法和冷凍保護(hù)劑對(duì)小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞冷凍－解凍后培養(yǎng)48 h細(xì)胞貼壁情況的影響

不同冷凍保存方法和冷凍保護(hù)劑對(duì)小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞冷凍－解凍后培養(yǎng)48 h細(xì)胞貼壁情況的影響見(jiàn)表3。

由表3可知，以100 mL／L DMSO作為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的冷凍保存時(shí)，方法3處理組的解凍復(fù)蘇后培養(yǎng)48 h細(xì)胞貼壁率與方法2無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但極顯著高于方法1和方法4處理組（P＜0.01）。以100 mL／L GL作為冷凍保護(hù)劑時(shí)，方法3處理組的解凍復(fù)蘇后培養(yǎng)48 h細(xì)胞貼壁率極顯著地高于其他各處理組（P＜0.01）。就同一種冷凍方法而言，100 mL／L DMSO作為冷凍劑處理組的解凍復(fù)蘇后培養(yǎng)48 h細(xì)胞貼壁率均高于100 mL／L GL處理組，且在方法2中表現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01），在方法3中表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）。因此，宜選用100 mL／L DMSO作為冷凍保護(hù)劑，采用方法3進(jìn)行冷凍保存可以獲得較高的小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞解凍復(fù)蘇后培養(yǎng)48 h細(xì)胞貼壁率。

表3 不同冷凍保存方法和冷凍保護(hù)劑對(duì)小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞解凍復(fù)蘇后培養(yǎng)48 h細(xì)胞貼壁率（%）的影響Table3 Effect of different cryopreservation methods and cryoprotectants on adhesive rate（%）of mouse ear skin fibroblasts after being thawed and cultured for 48 h

2.3 小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。圖1表明，培養(yǎng)1 d～2 d為小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的潛伏期，3 d～4 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5 d后細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始減少，為平臺(tái)期和衰退期。冷凍解凍后的細(xì)胞呈現(xiàn)正常的分裂增殖生長(zhǎng)模式，這表明以100 mL／L DMSO作為冷凍劑，采用方法3進(jìn)行冷凍保存對(duì)小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞后續(xù)生長(zhǎng)影響較小。

圖1 小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of the mouse ear skin fibroblasts

3 討論

3.1 不同冷凍保護(hù)劑對(duì)耳皮膚成纖維細(xì)胞冷凍效果的影響

冷凍保護(hù)劑是指通過(guò)稀釋溶液中的溶質(zhì)濃度，減少冷凍和解凍過(guò)程中對(duì)細(xì)胞造成的損傷（如細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰、脫水、溶質(zhì)濃度提高和蛋白質(zhì)變性及骨架結(jié)構(gòu)的損傷等）的某一類化合物［1］。50多年前，英國(guó)的一個(gè)研究小組在一次試驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)了對(duì)精子和人紅細(xì)胞的有效冷凍保護(hù)劑之后［2］，相繼出現(xiàn)了二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（ethylene glycol，EG）和甘油（GL）等其他冷凍保護(hù)劑，其最重要的特點(diǎn)是能夠穩(wěn)定滲入細(xì)胞，且在濃度為1 mol／L左右時(shí)對(duì)細(xì)胞相對(duì)無(wú)毒，其保護(hù)功能的基本機(jī)制是在降溫過(guò)程中透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使得細(xì)胞皺縮程度降低［3］。另外，葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羥乙基淀粉、聚乙二醇以及蔗糖等非滲透性冷凍保護(hù)劑的功能在于加快溶液的玻璃化，穩(wěn)定蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜，以及防止進(jìn)一步的結(jié)冰［4］。

目前多采用DMSO、GL或EG等作為細(xì)胞凍存的冷凍保護(hù)劑。這幾種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞膜，降低冰點(diǎn)以減少冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的毒性作用。王紅梅等［5］采用DMSO作為冷凍保護(hù)劑的效果好于EG，使用DMSO細(xì)胞存活率達(dá)到70%～90%，而EG只有30%～50%。任芳麗等［6］研究表明200 mL／L DMSO保護(hù)液對(duì)牛皮膚成纖維細(xì)胞的凍存保護(hù)效果好于其它濃度的DMSO、EG及GL，復(fù)蘇后平均貼壁率達(dá)到87.9%。趙雪萍等［7］比較了DMSO、GL和EG 3種冷凍保護(hù)劑對(duì)麋鹿耳皮膚成纖維細(xì)胞的冷凍保存效果，結(jié)果表明添加100 mL／L DMSO的凍存液效果最佳，解凍后細(xì)胞貼壁率達(dá)87.78%。王亮等［8］采用200 mL／L FBS＋100 mL／L DMSO＋70%細(xì)胞懸液對(duì)奶牛耳皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行凍存，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率達(dá)到86.68%，培養(yǎng)48 h貼壁率為86.40%。周向梅等［9］以100 mL／L DMSO＋900 mL／L FBS為冷凍保護(hù)液冷凍保存第3代矮馬耳緣組織成纖維細(xì)胞，復(fù)蘇后存活率達(dá)92.2%。本試驗(yàn)以100 mL／L FBS＋100 mL／L DMSO＋ DMEM 作為冷凍保護(hù)液，得到最高的細(xì)胞存活率為84.88%，培養(yǎng)48h后的細(xì)胞貼壁率為 81.00%；以 100 mL／L FBS＋100 mL／L GL＋DMEM作為冷凍保護(hù)液，得到最高的細(xì)胞存活率為71.65%，培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞貼壁率為67.03%。較 100 mL／L GL 相 比，100 mL／L DMSO作為冷凍保護(hù)劑效果更佳。但是，由于DMSO、GL和EG是一種有毒的化學(xué)物質(zhì)，高濃度下作為凍存保護(hù)劑也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，將DMSO提前4℃預(yù)冷，有利于降低其對(duì)細(xì)胞的毒性損害［8］。近年來(lái)，一些學(xué)者研發(fā)出了新型冷凍保護(hù)劑，如抗凍蛋白、乙酞胺、海藻糖、植物類抗凍因子等，這些凍存保護(hù)劑在低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞有較好的保護(hù)效果。

3.2 不同冷凍保存方法對(duì)耳皮膚成纖維細(xì)胞冷凍效果的影響

細(xì)胞冷凍效果受冷凍速率的影響。常規(guī)冷凍法下，若冷凍速率過(guò)快，則易形成胞內(nèi)冰晶，這些細(xì)胞內(nèi)冰晶在溫度回升過(guò)程中會(huì)發(fā)生再結(jié)晶而導(dǎo)致細(xì)胞受損；如果降溫速率過(guò)慢，則細(xì)胞收縮過(guò)劇烈，并且細(xì)胞處在高濃度溶液中也會(huì)引起損傷。本試驗(yàn)中，采用方法3的效果好于其他幾種方法，這可能與小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞懸掛在液氮罐內(nèi)的氣態(tài)氮中4 h，使細(xì)胞內(nèi)水分充分外滲又不完全脫干，從而減少冰晶形成，降低對(duì)細(xì)胞的損傷有關(guān)。氣態(tài)氮處理的方法在其他動(dòng)物細(xì)胞冷凍上也有使用，如陸會(huì)寧等［10］將凍存管在4℃冰箱中放置30 min～1 h后，在液氮面過(guò)夜，次日放入液氮罐中保存，解凍后貴德黑裘皮羊耳成纖維細(xì)胞存活力為93.16%，24 h后的貼壁率為85%；趙雪萍等［7］將凍存管在4℃放置30 min，移入－20℃放置1.5 h，再在液氮面上方懸吊7 h～8 h后投入液氮，解凍后麋鹿耳皮膚成纖維細(xì)胞貼壁率達(dá)87.78%。本試驗(yàn)中，方法1和方法2雖經(jīng)過(guò)預(yù)冷平衡，控制了降溫速率，但可能其速率仍會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，從而使細(xì)胞復(fù)蘇后存活率和貼壁率低于方法3。陳華等［11］比較了3種冷凍方法對(duì)波爾山羊成纖維細(xì)胞凍存效果的影響，結(jié)果表明方法3（4℃平衡1 h、－80℃過(guò)夜，然后投入液氮）冷凍細(xì)胞解凍后得細(xì)胞貼壁率為61.6%，明顯優(yōu)于方法1（4℃平衡1 h，－20℃冷凍6 h，直接投入液氮）和方法2（4℃平衡1 h，－20℃冷凍6 h，－80℃過(guò)夜，直接投入液氮），并認(rèn)為－20℃不利于細(xì)胞保存，推測(cè)可能是由于－20℃左右是細(xì)胞冷藏的危險(xiǎn)區(qū)域，且易發(fā)生低溫?fù)p傷，建議細(xì)胞在此階段不宜停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。許丹娜等［12］采用將凍存管在4℃下平衡30 min后置于－80℃超低溫冰箱過(guò)夜，第2天投入液氮的方法對(duì)食蟹猴成纖維細(xì)胞進(jìn)行凍存，解凍后第7代細(xì)胞的存活率達(dá)95.15%。關(guān)偉軍等［13］將凍存管放入裝有異丙醇的冷凍盒中，于－70℃冰箱中過(guò)夜，第2天放入液氮罐中保存，小尾寒羊耳組織成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率達(dá)94.7%。馬月輝等［14］采用同樣的方法冷凍保存矮馬耳緣組織成纖維細(xì)胞，復(fù)蘇后存活率達(dá)92.2%。但是，李忠秋等［15］采用4℃平衡40 min，在－20℃冷凍2 h，在－70℃過(guò)夜，次日投入液氮保存種公牛耳組織成纖維細(xì)胞，細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率也高達(dá)93.7%。因此，－20℃冷凍處理對(duì)細(xì)胞是否具有很大的損傷作用還有待進(jìn)一步的研究。另外，本試驗(yàn)中，采用方法4得到的細(xì)胞存活率、貼壁率顯著偏低，可能原因是降溫速率過(guò)快，形成胞內(nèi)冰晶，這些細(xì)胞內(nèi)冰晶在溫度回升過(guò)程中會(huì)發(fā)生再結(jié)晶而導(dǎo)致細(xì)胞受損。

因此，宜采用100 mL／L DMSO冷凍保護(hù)劑，經(jīng)4℃預(yù)冷平衡0.5 h，接著懸掛在液氮罐內(nèi)的氣態(tài)氮中4 h，然后沉入液氮的方法凍存小鼠耳皮膚成纖維細(xì)胞。

［1］郭 娟.牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存的研究［D］.新疆烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［2］Rapatz G，Nath J，Luyet B.Electron microscope study of erythrocytes in rapidly frozen mammalian blood［J］.Biodynamica，1963，9：83－94.

［3］Woods E J，Zieger M A，Gao D Y，et al.Equations for obtaining melting points for the ternary system ethylene glycol／sodium chloride／water and their application to cryopreservation［J］.Cryobiology，1999，38（4）：403－407.

［4］高大勇，丁力行，呂金虎，等.細(xì)胞冷凍保存的最佳降溫速率及其影響因素［J］.仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，20（3）：54－59.

［5］王紅梅，黃俊成，劉明軍，等.利用動(dòng)物耳皮膚組織培養(yǎng)耳成纖維細(xì)胞的研究［J］.草食家畜，2001（S2）：210－214.

［6］任芳麗，李 煌，張 涌.牛皮膚成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)與凍存［J］.黃牛雜志，2002，28（1）：8－10.

［7］趙雪萍，張寒瑩，王子玉，等.麋鹿耳皮膚成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)與核型分析［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（1）：67－71.

［8］王 亮，劉婷婷，彭 濤，等.荷斯坦奶牛耳組織成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)及冷凍保存方法研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006，5：9－12.

［9］周向梅，馬月輝，關(guān)偉軍，等.云南矮馬耳緣組織成纖維細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào)，2004，50（5）：863－868.

［10］陸會(huì)寧，劉丑生，王志剛.貴德黑裘皮羊耳成纖維細(xì)胞系的建立和生物學(xué)特性的研究［J］.中國(guó)草食動(dòng)物，2007，27（2）：3－6.

［11］陳 華，朱必龍，章孝榮.波爾山羊耳成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)與保存［J］.黑龍江動(dòng)物繁殖，2007，15（3）：7－10.

［12］許丹娜，許惠艷，凌澤繼，等.食蟹猴耳部成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的初步建立［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，36（3）：469－475.

［13］關(guān)偉軍，馬月輝，丁 鴻，等.小尾寒羊耳組織成纖維細(xì)胞系的建立與生物學(xué)特性研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36（5）：511－516.

［14］馬月輝，周向梅，關(guān)偉軍，等.用膠原酶消化法培養(yǎng)德保矮馬耳緣組織成纖維細(xì)胞初探［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（6）：1282－1288.

［15］李忠秋，馬 紅，郭鎮(zhèn)華，等.種公牛耳組織成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，46（2）：18－20.