高效液相色譜法測定甲氧芐啶含量

邵耀東，胡 彬，趙小華，謝紀(jì)蘭，鄭貴超

（1.青島康地恩藥業(yè)股份有限公司，山東青島266111；2.江西康地恩派尼生物藥業(yè)有限公司，江西南昌330500）

甲氧芐啶（trimethoprim TMP）為廣譜抗菌藥物，抗菌譜與磺胺類藥物類似，有抑制二氫葉酸還原酶的作用，但細(xì)菌較易產(chǎn)生耐藥性，很少單獨(dú)使用［1］?；前匪幰种贫淙~酸合成酶，兩者合用，可使細(xì)菌的葉酸代謝受到雙重阻斷，因而抗菌作用大幅度提高（可增效數(shù)倍至數(shù)十倍），故有磺胺增效劑之稱，并可減少耐藥菌株的出現(xiàn)，廣泛應(yīng)用于我國獸醫(yī)臨床［2－3］。有關(guān)甲氧芐啶原料含量測定方法，《中國獸藥典》2005年版［4］和2010年版［5］都是非水滴定法來測定含量，非水滴定法影響因素很多，整個測定過程復(fù)雜，對環(huán)境要求較高，終點(diǎn)判定不準(zhǔn)，測定結(jié)果不太理想。高效液相色譜法是目前多數(shù)藥物含量測定時應(yīng)用的方法，該方法專屬性強(qiáng)、操作簡便、重現(xiàn)性較好。為了提高甲氧芐啶含量測定的速度，簡化操作過程，確保測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，筆者利用HPLC法進(jìn)行了甲氧芐啶原料含量測定的研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 UV－2450型紫外分光光度儀為日本島津公司產(chǎn)品；戴安170型高效液相色譜儀為美國戴安公司產(chǎn)品；AG285分析天平為瑞士梅特勒－托利多公司生產(chǎn)產(chǎn)品。

1.1.2 藥品 甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號為H0160704；甲氧芐啶原料藥為壽光富康制藥有限公司生產(chǎn)，批號為201009027、201009036、201010015、201010029和201010346；甲醇，色譜純，德國默克公司生產(chǎn)；其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 檢測波長選擇 精密稱量甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品，加流動相：甲醇∶0.02 mol／L磷酸二氫鉀溶液（30∶70）制成每1 mL中含10μg的溶液，以流動相溶液為空白對照，在200 nm～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收圖譜掃描，并確定檢測波長。

1.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Diamonsil C18柱（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇∶0.02 mol／L磷酸二氫鉀溶液（30∶70）；流速1.0 mL／min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量為10μL；紫外檢測波長271 nm。理論板數(shù)按甲氧芐啶峰計算不低于2 500。

1.2.3 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密稱取甲氧芐啶對照品適量，加流動相溶解并稀釋成0.2 mg／mL的對照品貯備液；精密量取該貯備液，用流動相溶液分別稀釋制成10、20、40、80、160μg／mL 的待測液。依據(jù)1.2.2方法測定，記錄峰面積，以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（C，μg／mL）進(jìn)行線性回歸。

1.2.4 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為80μg／mL的甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依據(jù)1.2.2方法測定，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取批號為201009027的甲氧芐啶原料藥適量，加流動相溶解并稀釋成約40μg／mL的溶液，搖勻。分別于0、10、20、30、40、60、90 min時，依據(jù)1.2.2方法測定，記錄峰面積。

1.2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取批號為201009036的甲氧芐啶原料藥5份，依據(jù)1.2.3方法制備供試品溶液，并依據(jù)1.2.2方法，按照外標(biāo)法進(jìn)行甲氧芐啶含量測定。

1.2.7 加樣回收試驗(yàn) 取已知質(zhì)量濃度的供試品（批號為201010346）溶液，分為5份，分別精密加入甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液（10.08μg／mL）1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，制備待測溶液，并依據(jù)1.2.2方法，按照外標(biāo)法進(jìn)行甲氧芐啶含量測定。

1.2.8 樣品含量測定 取甲氧芐啶原料藥及標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱量，加流動相制成每1 mL中含40 μg／mL的溶液，精密量取10μL注入色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計算含量。同時采用《中國獸藥典》2010年版一部甲氧芐啶含量測定方法測定含量，然后將兩種方法測定結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇

由圖1可見甲氧芐啶在205 nm、271 nm波長處有最大吸收?？紤]到200 nm附近有“邊緣效應(yīng)”，容易導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定，故選擇271 nm為測定波長。

圖1 甲氧芐啶紫外吸收圖譜Fig.1 UV of trimethoprim

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

由圖2可知，甲氧芐啶的保留時間約為5.9 min，由高效液相化學(xué)工作站可以得出其理論板數(shù)大于3 000，故在此色譜條件下滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。

圖2 甲氧芐啶液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of trimethoprim

2.3 線性關(guān)系結(jié)果

按“1.2.3”項(xiàng)下方法，以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（C，μg／mL）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明甲氧芐啶質(zhì)量濃度在10μg／mL～160μg／mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，檢測數(shù)據(jù)及回歸方程如表1所示。

2.4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

按“1.2.4”項(xiàng)下方法得出，甲氧芐啶峰面積的RSD為0.73%（n＝5），峰面積見表2。表明該方法具有較高的精密度。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

按“1.2.5”項(xiàng)下方法得出，甲氧芐啶原料藥峰面積的RSD為0.99%（n＝7），峰面積見表3。表明樣品溶液在該體系下90 min內(nèi)穩(wěn)定。

表1 線性關(guān)系結(jié)果Table1 Results of linear relation

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of precision tests

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

按“1.2.6”項(xiàng)下方法得出，其含量的 RSD 為0.66%（n＝5），含量見表4。表明方法重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收試驗(yàn)

按“1.2.7”項(xiàng)下方法，由表5結(jié)果可得出該方法加樣回收率較高。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table3 The results of stability tests

2.8 兩種含量測定方法測定結(jié)果

按“1.2.8”方法，由表6結(jié)果可得出兩種方法測定結(jié)果無顯著差異，表明這兩種測定方法測定結(jié)果一致。

表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Table4 The results of reproducibility tests

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table5 The results of recovery tests

表6 含量測定結(jié)果比較Table6 Comparison of determination results

高效液相色譜法測定甲氧芐啶的含量。色譜柱為Diamonsil C18柱（200 mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇∶0.02 mol／L磷酸二氫鉀（30∶70），流速為1.0 mL／min，柱溫為25℃，檢測波長為271 nm，流動相作為樣品的稀釋劑，進(jìn)樣量10μL。甲氧芐啶質(zhì)量濃度在10μg／mL～160μg／mL范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，回歸方程A＝0.389 2C－0.369 6，r＝0.999 9（n＝5）。

3 討論

甲氧芐啶制劑中含量的測定方法有多種，羅蘭等［6］、張桂枝等［7］采用了分光光度法，程志民等［8］采用了熒光分光光度法，宋慧敏等［9］、農(nóng)毅清等［10］、魏京京等［11］、陳 玉 華［12］、郭時金 等［13］、陳慶偉等［14］、馮學(xué)忠等［15］《中國獸藥典》2010年版［5］都采用高效液相色譜法進(jìn)行了測定，但是對于甲氧芐啶原料藥含量的測定，目前只有《中國獸藥典》2005年版［4］和2010年版［5］上面的非水滴定法。非水滴定法測定過程中影響因素較多，存在測定結(jié)果不穩(wěn)定的弊端。筆者采用高效液相色譜法對甲氧芐啶原料藥含量進(jìn)行測定，對該方法的線性關(guān)系考察、精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重現(xiàn)性試驗(yàn)、加樣回收試驗(yàn)等一系列試驗(yàn)，結(jié)果顯示該方法穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性較好、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為今后能準(zhǔn)確快速的測定甲氧芐啶的含量打下了基礎(chǔ)。

隨著獸藥GMP的推進(jìn)，獸藥生產(chǎn)企業(yè)為了達(dá)到獸藥GMP的認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)，都購買了高效液相色譜儀，故高效液相色譜法測定甲氧芐啶含量的方法可以在獸藥企業(yè)進(jìn)行很好推廣使用。

［1］中國獸藥典委員會.獸藥使用指南（化學(xué)藥品卷）二〇一〇年版［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：88.

［2］催一喆，王 新，韓鐵鎖.甲氧芐啶對白頭翁體外抗菌增效作用及量效關(guān)系的試驗(yàn) ［J］.中國獸醫(yī)雜志，2010，46（9）：44－46.

［3］王 新，崔一喆，韓鐵鎖.甲氧芐啶對黃芩苷體外抗菌增效作用的試驗(yàn) ［J］.中國獸醫(yī)雜志，2010，46（11）：69－70.

［4］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇〇五年版一部［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：50－51.

［5］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版一部［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：53－54，392

［6］羅 蘭，賴光超，曾常青.系數(shù)倍率法同時測定復(fù)方磺胺甲噁唑片中磺胺甲噁唑和甲氧芐啶的含量［J］.海峽藥學(xué)，2010，22（9）：33－35.

［7］張桂枝，靳雙星，焦喜蘭.雙波長分光光度法測定復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液中兩主藥的含量［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，19（4）：21－23.

［8］程志民，齊正保，朱蔓菁.多元校正恒波長同步熒光法同時測定甲氧芐啶和諾氟沙星［J］.江西科學(xué)，2010，28（3）：301－303.

［9］宋慧敏，畢昊容，邵德佳，等.獸藥粉劑／預(yù)混劑中甲氧芐啶的測定［J］.中國獸藥雜志，2007，41（1）：33－35.

［10］農(nóng)毅清，蔣 林，莫海玲.HPLC法測定復(fù)方磺胺甲噁唑糖漿中磺胺甲噁唑及甲氧芐啶的含量［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008，2（7）：1－3.

［11］魏京京，張啟明，金少鴻.HPLC法測定聯(lián)磺甲氧芐啶片的含量［J］.中國藥事，2009，23（6）：565－567.

［12］陳玉華.頭孢羥氨芐甲氧芐啶分散片的含量測定研究［J］.海峽藥學(xué)，2010，22（7）：83－86.

［13］郭時金，沈志強(qiáng)，張志美，等.HPLC法檢測磺胺間甲氧嘧啶鈉和甲氧芐啶方法的研究［J］.家畜生態(tài)學(xué)報，2010，31（4）：73－76.

［14］陳慶偉，林小毅.高效液相法測定磷霉素鈣甲氧芐啶膠囊中甲氧芐啶的含量［J］.海峽藥學(xué)，2008，20（5）：41－42.

［15］馮學(xué)忠，黎華鵬，盤苑芷，等.HPLC同時測定復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉中地美硝唑、甲氧芐啶、磺胺對甲氧嘧啶的含量［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（7）：55－60.