豬痘病毒研究進(jìn)展＊

蘆曉立，張 強，顏新敏

（1.商洛學(xué)院生物醫(yī)藥工程系，陜西 商洛 72600；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點開放實驗室，甘肅 蘭州 730046）

豬痘（Swinepox，SWP）是由豬痘病毒（Swinepox virus，SWPV）或痘苗病毒（Vaccinia virus，VACV）引起的豬的一種急性、熱性病毒性傳染病。豬痘易發(fā)生于幼豬、育肥豬，潛伏期5d～7d。典型病例初呈現(xiàn)紅斑，遍布全身，繼而出現(xiàn)孤立圓形丘疹，凸出于皮膚，發(fā)展成水皰。轉(zhuǎn)為膿皰破潰形成痂皮，一般很少影響進(jìn)食，飲水正常，整個發(fā)展過程患豬表現(xiàn)奇癢難耐，蹭墻壁、圍欄。同群豬感染率可達(dá)100%，但病死率一般不超過3%～5%，多數(shù)是因并發(fā)癥造成死亡。近期廣東增城、四會等區(qū)域廣泛流行豬痘病，雖然發(fā)病豬死亡率不高，但乳仔豬發(fā)病率較高（局部區(qū)域達(dá)80%以上），給生豬生產(chǎn)帶來潛在的危害，嚴(yán)重影響了豬的生長和豬場效益，應(yīng)引起我們關(guān)注[1]。

1 理化特征

豬痘病毒屬（Suipoxvirus，SPV）歸屬于脊椎動物痘病毒亞科（Chordopoxvirinae），豬痘病毒屬只有一個成員SWPV。SWPV粒子為磚形或卵圓形，大小為（200～390）nm×（100～260）nm，但也有報道為（208～422）nm×（164～328）nm[1]，有囊膜，是最大型病毒。電鏡下可見電子密度為五層的結(jié)構(gòu)和多個薄層核芯，它可能處于形成形態(tài)異常病毒體囊膜的過程中。在病毒核芯兩層囊膜的內(nèi)層襯有一電子密度高的物質(zhì)，目前尚不清楚它是核芯的一部分還是第3層嚢膜[2]。

SWPV對皮膚和黏膜上皮細(xì)胞有特殊的親和力，能在豬的皮膚上皮、腎細(xì)胞、睪丸細(xì)胞和豬胎肺細(xì)胞等增殖，并產(chǎn)生細(xì)胞病變，包括胞核空泡化以及形成核內(nèi)包涵體，SWPV不能在來源于牛、羊、鼠和人的細(xì)胞培養(yǎng)物中生長，也不能在雞胚和雞胚細(xì)胞內(nèi)增殖。SWPV只能使豬發(fā)病，將該病毒接種犢牛、鴿、豚鼠、雞胚、家兔、大鼠、小鼠、綿羊、山羊、人等均未獲成功，但可在家兔體內(nèi)連傳3代。用高濃度的病毒可引起皮膚局部損傷，但病毒不能在兔皮膚內(nèi)增殖[2]。

SWPV對干燥和寒冷抵抗力很強，可以在這種環(huán)境下存活3個月以上。干燥的痂皮中病毒可存活幾個月，在正常的土壤中可存活幾周。SWPV熱穩(wěn)定性較好，于37℃放置10d～12d，仍有活力。對直射陽光、紫外線、高溫、堿和消毒液均敏感。對常用消毒藥都敏感，5mL／L的福爾馬林，30mL／L的石碳酸，0.1g／L的碘溶液，30mL／L的硫酸或鹽酸可以在數(shù)分鐘內(nèi)將病毒殺死；10g／L～30g／L的火堿和700mL／L的消毒酒精10min可殺死病毒[3]。

2 分子特性

2002年獲得了SWPV的完整核苷酸序列，基因組長146kbp[4]。G＋C的含量為27.5%，A＋T占有很大比重，尤其在中心編碼區(qū)域高達(dá)95%?；虻哪┒擞?個反向末端重復(fù)序列（identical inverted terminal repeat，ITR），SWPV含有150個目前被公認(rèn)的開放式閱讀框（open reading frame，ORF），其中4種基因和痘病毒沒有同源性，除此以外保守的中央核心區(qū)有106個基因和其他哺乳動物痘病毒同源，它們包含了基礎(chǔ)的病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、病毒的組裝和成熟的相關(guān)基因。ITR可能具有調(diào)節(jié)或逃逸宿主的免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)或抑制宿主細(xì)胞凋亡、細(xì)胞和組織嗜性等作用[4]。SWPV肯定存在一個確定宿主范圍的基因，即把病毒限制在主要宿主范圍內(nèi)，這類基因還有待于研究。

3 豬痘病毒基因編碼蛋白

3.1 分泌型、細(xì)胞膜蛋白

分泌型或細(xì)胞膜蛋白是天然的病毒免疫調(diào)節(jié)劑，具有中斷或調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答作用[11－12]。它們都有其預(yù)測的信號肽，通過對信號肽研究表明潛在的分泌型蛋白包括IFN－γ受體、IFN－α／β結(jié)合蛋白、IL－18結(jié)合蛋白和類似于 TNF－α潛在蛋白[5]。SWPV包含2個跨膜G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體（G－protein－coupled receptor，GPCR）、CD47和 MARCH 家族泛素連接酶，它們都編碼細(xì)胞免疫調(diào)制劑[6－7]。SWPV中的2個GPCR和細(xì)胞或病毒趨化因子受體同源，它被表達(dá)在感染細(xì)胞的表面，并在與趨化因子結(jié)合后激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1／2）[8]。SPV009包含一個LAP／PHD／RING－CH區(qū)域類似于細(xì)胞和病毒MARCH家族的細(xì)胞膜泛素連接酶，能夠降低宿主細(xì)胞表面的免疫糖蛋白表達(dá)，這種免疫糖蛋白包括 MHCI類、Fas－CD95、CD4、M153R蛋白、泛素連接酶和黏液瘤病毒的致病因子[7，9]。

3.2 宿主范圍、逃避免疫功能蛋白

一些SWPV蛋白質(zhì)有決定宿主范圍和逃避其免疫的功能。這些蛋白質(zhì)類似于蛋白激酶抑制劑，它能產(chǎn)生抗干擾素的抗病毒效果和決定病毒的宿主范圍[11]。目前已確定痘病毒絲氨酸蛋白酶抑制劑有消炎的功能，SWPV中的SPV145存在絲氨酸蛋白酶抑制劑編碼區(qū)，且與牛疙瘩皮膚病（Lumpy skin disease virus，LSDV）SPV149、雅巴痘病毒（Yabalike disease virus，YLDV）YLDV149R和黏液瘤病毒 （Myxoma virus，MYXV）M151R 同源[6]。SPV001、SPV007、SPV133、SPV135和SPV150 類似于痘病毒家族基因，痘病毒家族基因其中就包括VACV A52R（家族5[11]）。VACV A52R毒力因子和與VACV A52R蛋白質(zhì)序列相似的VACV的其他蛋白能夠降低宿主細(xì)胞IL－1R／Toll－like受體（TLR），這種降低是一種先天免疫機制和炎癥反應(yīng)[12－14]。因此，推斷SWPV中的類似基因也具有相同的功能。

3.3 毒力、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和細(xì)胞凋亡反應(yīng)蛋白

這些類似的蛋白有MYXV M011L細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白 （SPV012）和 VACV A14.5L 毒力蛋白（SPV103），VACV C7L 宿主范圍蛋白（SPV064），SWPV中心編碼區(qū)域與兔痘病毒、亞塔痘病毒和山羊痘病毒同源[4]。SPV138編碼的蛋白類似于正痘病毒的P28，P28是一種E3泛素連接酶[15]。SWPV還編碼4種蛋白質(zhì)（SPV141～SPV144），它們含有錨蛋白重復(fù)基因，痘病毒錨蛋白的基因與認(rèn)定宿主范圍、阻止被感染細(xì)胞凋亡、影響病毒毒力和病毒與宿主的相互作用都有重要的意義[16－17]。相類似的，SPV006、SPV015和SPV136與痘病毒的Kelch蛋白同源。已經(jīng)被證實痘病毒Kelch蛋白突變在體外能改變宿主范圍，在體內(nèi)能改變免疫和病毒的衰減[18－20]。

3.4 其他蛋白質(zhì)

SWPV末端序列編碼的蛋白質(zhì)，有一些具有潛在調(diào)解病毒／宿主的相互作用的功能，這些蛋白質(zhì)中包括痘病毒同源蛋白類似的細(xì)胞酶，如SPV128（羥類固醇脫氫酶），山羊痘病毒和兔痘病毒也都存在這個蛋白基因。還有如SPV129（超氧化物歧化酶）、SPV130（DNA連接酶）和SPV140（酪氨酸蛋白激酶）[4]。SWPV編碼的一個獨特的完整的參與核苷酸新陳代謝的酶，即核糖核苷酸還原酶，這種酶的大亞基在山羊痘病毒、兔痘病毒和亞塔病毒中不存在。SWPV中的SPV131編碼的蛋白質(zhì)（1959個氨基酸）與天花病毒毒株（孟加拉國）B22R同源，這個蛋白質(zhì)是一個功能未知的膜蛋白。

4 診斷和作為載體

豬痘的臨床診斷不難，由于豬痘可由豬痘病毒或痘苗病毒引起，實驗室內(nèi)有時需要加以鑒別。豬痘病毒具有嚴(yán)格的宿主特異性。自然條件下除豬外不感染其他動物。實驗感染除家兔出現(xiàn)迅速愈合的局部病變外，雞胚和任何其他動物均不發(fā)生感染。且除豬源細(xì)胞外，不能在其他動物來源的細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖。相反，痘苗病毒的宿主和細(xì)胞感染范圍極廣。再者，這兩種病毒的抗原性不同，感染豬痘病毒的恢復(fù)豬仍對痘苗病毒有感染性，反之亦然。

豬痘病毒和痘苗病毒在血清學(xué)上無關(guān)，因此，各種血清學(xué)試驗，如凝膠電泳、免疫電滲電泳、膠固補體吸附試驗、熒光抗體技術(shù)和中和試驗亦被用于二者之間的鑒別診斷[2]。

恢復(fù)豬具有堅強持久的免疫力，通常不易發(fā)現(xiàn)病毒中和抗體?？诜i痘病毒，可產(chǎn)生低水平循環(huán)抗體和腸道中和抗體。ELISA檢測有高滴度抗體反應(yīng)。該病毒有希望成為表達(dá)豬腸道病毒保護(hù)性抗原的病毒載體。

由于其宿主范圍限制，已提出使用SWPV作為疫苗載體?；蚬こ梯d體SWPV表達(dá)偽狂犬病病毒（PRV）和豬瘟病毒抗原已建成，可誘導(dǎo)豬產(chǎn)生免疫反應(yīng)[21]。SWPV能夠表達(dá)非豬病毒抗原可能是一種安全的宿主范圍限制的疫苗載體（非豬品種）[22－23]。重組的SWPV可進(jìn)行細(xì)胞免疫共刺激分子的表達(dá)，因此SWPV可作為基礎(chǔ)的疫苗佐劑[24]。

5 防控關(guān)鍵技術(shù)

病豬康復(fù)后可以抵抗再次感染，其血清中不含中和抗體，但新生仔豬可從免疫母豬體內(nèi)獲得母源抗體。將在仔豬睪丸細(xì)胞中增殖的豬痘病毒1414株接種于110只各種年齡的豬（包括哺乳仔豬），僅在接種部位發(fā)現(xiàn)典型的痘疹病灶，而未見任何其他不良反應(yīng)。所有接種豬免疫期至少4個月。豬痘康復(fù)豬對痘苗病毒仍十分易感[2]。

豬痘暴發(fā)期間，加強飼養(yǎng)管理對減少損失非常重要。隔離病豬，隔離哺乳豬到仔豬長至6周齡也有助于控制疾病的傳播?？刂剖涌梢詼p少損失。由于該病可通過外寄生蟲傳播，因此分別用有機磷合劑和抗生素除虱和治療膿腫可以從豬群中消滅豬痘。同時應(yīng)避免將不同種群混群飼養(yǎng)[2]。

加強飼養(yǎng)管理，合理調(diào)制飼料，搞好豬舍衛(wèi)生，徹底消滅豬虱。對病豬及時隔離治療，可用10g／L鹽水沖洗患部，然后涂10g／L～20g／L龍膽紫或氧化鋅軟膏，同時服用病毒靈，療效較好。如有繼發(fā)感染可用抗生素或磺胺類藥物治療。對被污染的用具和豬舍，可用20g／L～30g／L來蘇兒或10g／L～30 g／L堿性鈉溶液消毒。墊草要焚燒，糞便堆積發(fā)酵后作肥料。新購入的生豬隔離觀察1周～2周，防止帶入豬痘病毒。

6 結(jié)語

豬痘給生豬生產(chǎn)帶來潛在的危害，造成養(yǎng)殖業(yè)巨大損失；同時，因豬痘病毒是一種安全的宿主范圍限制的疫苗載體，目前被廣泛地用于豬和非豬病毒抗原表達(dá)載體。目前國內(nèi)對豬流感病毒H1N1亞型HA1蛋白重組豬痘病毒已經(jīng)獲得成功，重組豬痘病毒能穩(wěn)定表達(dá)HA1蛋白，并能有效地刺激機體的免疫保護(hù)反應(yīng)，能夠在制備預(yù)防或治療H1N1亞型豬流感病毒感染的藥物中應(yīng)用，并申請了專利[25]?？梢娯i痘病毒載體的應(yīng)用前景十分廣闊。對豬痘病毒的分子生物學(xué)、載體疫苗的進(jìn)一步研究，將為痘病毒的研究、基因工程疫苗的研制及豬痘的防控起到至關(guān)重要的作用。

[1]吳星和.區(qū)域性流行豬痘病的防控[J].廣東飼料，2011，20（7）：46.

[2]Garg S K.Swinepox virus[J].Vet Bulle，1989，59（6）：441－447.

[3]宣長和.豬病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2003：68.

[4]Afonso C L，Tulman E R，Lu Z，et al.The genome of swinepox virus[J].J Virol，2002，76：783－790.

[5]Brunetti C R，Paulose－Murphy M，Singh R，et al.A secreted high－affinity inhibitor of human TNF from Tanapox virus[J].Procatl Acad Sci USA，2003，100：4831－4836.

[6]Massung R F，Jayarama V，Moyer R W.DNA sequence analysis of conserved and unique regions of swinepox virus：identification of genetic elements supporting phenotypic observations including a novel G protein－coupled receptor homologue[J].Virology，1993，197：511－528.

[7]Bartee E，Mansouri M，Hovey Nerenberg B T，et al.Downregulation of major histocompatibility complex class I by human ubiquitin ligases related to viral immune evasion proteins[J].J Virol，2004，78：1109－1120.

[8]Najarro P，Lee H J，F(xiàn)ox J，et al.Yaba－like disease virus protein 7Lis a cell－surface receptor for chemokine CCL1[J].J Gen Virol，2003，84：3325－3336.

[9]Mansouri M，Bartee E，Gouveia K，et al.The PHD／LAP－domain protein M153Rof myxomavirus is a ubiquitin ligase that induces the rapid internalization and lysosomal destruction of CD4[J].J Virol，2003，77：1427－1440.

[10]Langland J O，Jacobs B L.The role of the PKR－inhibitory genes，E3Land K3L，in determining vaccinia virus host range[J].Virology，2002，299：133－141.

[11]Smith G L，Chan Y S，Howard S T.Nucleotide sequence of 42 kbp of vaccinia virus strain WR from near the right inverted terminal repeat[J].J Gen Virol，1991，72：1349－1376.

[12]Bowie A G，Haga I R.The role of toll－like receptors in the host response to viruses[J].Mol Immunol，2005，42：859－867.

[13]Stack J，Haga I R，Schroder M，et al.Vaccinia virus protein A46Rtargets multiple toll－like－interleukin－1receptor adaptors and contributes to virulence[J].J Exp Med，2005，201：1007－1018.

[14]Di Perna G，Stack J，Bowie A G，et al.Poxvirus protein N1L targets the I－KB kinase complex，inhibits signaling to NF－KB by the tumor necrosis factor superfamily of receptors，and inhibits NF－KB and IRF3signaling by Toll－like receptors[J].J Biol Chem，2004，279：36570－36578.

[15]Nerenberg B T，Taylor J，Bartee E，et al.The 214Gustavo A.Delhon et al.poxviral RING protein p28is a ubiquitin ligase that targets ubiquitin to viral replication factories[J].J Virol，2005，79：597－601.

[16]Camus－Bouclainville C，F(xiàn)iette L，Bouchiha S，et al.A virulence factor of myxoma virus colocalizes with NF－kB in the nucleus and interferes with inflammation[J].J Virol，2004，78：2510－2516.

[17]Johnston J B，Wang G，Barrett J W，et al.Myxoma virus M－T5 protects infected cells from the stress of cell cycle arrest through its interaction with host cell cullin－1[J].J Virol，2005，79：10750－10763.

[18]Kochneva G，Kolosova I，Maksyutova T，et al.Effects of deletions of kelch－like genes on cowpox virus biological properties[J].Arch Virol，2005，150：1857－1870.

[19]Tulman E R，Afonso C L，Lu Z，et al.The genomes of sheeppox and goatpox viruses[J].J Virol，2002，76：6054－6061.

[20]Pires de Miranda M，Reading P C，Tscharke D C，et al.The vaccinia virus kelch－like protein C2Laffects calcium－independent adhesion to the extracellular matrix and inflammation in a murine intradermal model[J].J Gen Virol，2003，84：2459－2471.

[21]Hahn J，Park S H，Song J Y，et al.Construction of recombinant swinepox viruses and expression of the classical swine fever virus E2protein[J].J Virol Methods，2001，93：49－56.

[22]Winslow B J，Cochran M D，Holzenburg A，et al.Replicationand expression of a swinepox virus vector delivering feline leukemia virus gag and env to cell lines of swine and feline origin[J].Virus Res，2003，98：1－15.

[23]Barcena J，Blasco R.Recombinant swinepox virus expressing beta－galactosidase：investigation of viral host range and gene expression levels in cell culture[J].Virology，1998，243：396－405.

[24]Winslow B J，Kalabat D Y，Brown S M，et al.Feline B7.1and B7.2proteins produced from swinepox virus vectors are natively processed and biologically active：Potential for use as non－chemical adjuvants[J].Vet Microbiol，2005，111：1－13.

[25]許家榮，陸承平，黃冬艷.豬流感病毒H3N2亞型HA1蛋白重組豬痘病毒及其制備方法[P].中國專利：CN102154366A，2011－08－17.