豬源乳酸菌抑制致病性大腸埃希菌研究＊

倪敬軒，楊 英

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

豬大腸埃希菌病是由致病性大腸埃希菌的某些血清型引起的豬不同疾病的統(tǒng)稱，以新生和幼齡豬為主的腸道傳染病為特征。包括仔豬黃白痢、仔豬水腫病、仔豬斷奶腹瀉等，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的威脅和重大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

乳酸菌是仔豬腸道的優(yōu)勢(shì)菌。一方面，乳酸菌與病原菌競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)，抑制有害菌在消化道的增殖。另一方面，乳酸菌產(chǎn)生抑制病原菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，如細(xì)菌素（bacteriocin）、過(guò)氧化氫、二氧化碳、有機(jī)酸等可抑制病原菌，調(diào)整胃腸道菌群平衡。Barrow P A給仔豬飼喂乳酸菌可顯著降低腸道中大腸埃希菌的數(shù)量[2－4]。

本研究以健康仔豬新鮮糞便為菌源，對(duì)乳酸菌進(jìn)行分離與鑒定，就所獲得的菌株進(jìn)行抑菌性篩選、生長(zhǎng)曲線和pH的測(cè)定研究，以期獲得適合仔豬用微生態(tài)制劑優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 用棉拭子法從薩拉齊、東勝和集寧3個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)采集2、5、11、17、25、30（斷奶）、38、42d共8個(gè)日齡的健康仔豬新鮮糞便。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 3株致病性大腸埃希菌（CVCC195、CVCC 224、CVCC1477），購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心；嗜酸乳桿菌（CICC6095），購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌株保藏中心；植物乳桿菌，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院提供。

1.1.3 主要試劑和儀器 微量生化鑒定管購(gòu)自廣東環(huán)凱生物微生物科技有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生工生物工程（上海）有限公司；核酸染料、DNA Marker DL 5000購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；EasyTaqTM DNA Polymerase購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TPY液體培養(yǎng)基，MRS液體、半固體、固體培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[5－6]均自行配制。

厭氧培養(yǎng)箱 （1029Forma Autoclave System，Thermo Electron Corporation）；FD－1真空冷凍干燥機(jī)；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5417R，德國(guó)）；BCN－1360型生物潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；PCR擴(kuò)增儀（Eppendorf，德國(guó)）；DYY－12型電泳儀（北京市六一儀器廠）；紫外凝膠成像分析系統(tǒng)（Biorad，意大利）；牛津杯（內(nèi)徑6.00mm±0.10mm，外徑7.80mm±0.10mm，高10.00mm±0.10mm）。

1.2 方法

1.2.1 樣品富集、分離、純化 樣品放入TPY液體培養(yǎng)基，38℃下厭氧富集培養(yǎng)24h。用接種環(huán)取培養(yǎng)液劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基中，38℃厭氧培養(yǎng)24h。待菌落形成后，每個(gè)平皿挑取4個(gè)～6個(gè)有融鈣圈的形態(tài)、大小、顏色、光澤、透明度各異的菌落再次劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基上，38℃下厭氧培養(yǎng)24h，挑取單菌落的一半做革蘭染色。如果菌落純化良好則將另一半菌落穿刺保存或加凍菌保護(hù)液后冷凍保存；如果菌落鏡檢不純則繼續(xù)劃線培養(yǎng)，直至菌落特征和菌株鏡檢純化良好[7]。

1.2.2 牛津杯法篩選 按文獻(xiàn)[8－9]進(jìn)行。初篩以3株致病大腸埃希菌作為指示菌，測(cè)定分離菌株發(fā)酵上清液的抑菌活性，保留具有抑菌活性的菌株。分離菌株和3株致病大腸埃希菌分別通過(guò)MRS液體培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基活化3代，在內(nèi)徑一致的平皿中加入15mL水瓊脂。待凝固完全后，每個(gè)平皿中均勻放置7個(gè)滅菌牛津杯，緩慢倒入30mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂（含106CFU個(gè)大腸埃希菌）。待第2層培養(yǎng)基完全凝固，用鑷子拔出牛津杯，用移液槍向牛津杯形成的小孔內(nèi)加入0.2mL分離菌株發(fā)酵產(chǎn)物上清液，中間孔加入0.2mL MRS液體培養(yǎng)基。加樣完畢后平皿放入4℃冰箱中擴(kuò)散12h后放38℃下培養(yǎng)24h左右，待孔內(nèi)上清液擴(kuò)散完全。觀察抑菌環(huán)的有無(wú)，保留有抑菌作用的菌株，每個(gè)樣品進(jìn)行兩個(gè)平行試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次；復(fù)篩方法同初篩。每個(gè)抑菌環(huán)用游標(biāo)卡尺在不同位置測(cè)3次直徑取平均值，保留抑菌作用最強(qiáng)的菌株，每個(gè)樣品兩個(gè)平行，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 生化鑒定 參照文獻(xiàn)[7，10]進(jìn)行。對(duì)革蘭陽(yáng)性無(wú)芽胞桿菌做硝酸鹽還原試驗(yàn)，明膠液化試驗(yàn)，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，靛基質(zhì)試驗(yàn)和硫化氫試驗(yàn)以及運(yùn)動(dòng)性檢查。鑒定為乳桿菌屬的乳酸菌通過(guò)糖發(fā)酵試驗(yàn)進(jìn)行乳酸桿菌的種間鑒定，用植物乳桿菌作陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 分子鑒定 依據(jù)乳酸桿菌16SrRNA基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物F（5′－CTGGCGGCGTGCCTAATA－3′）和R（5′－CGCTCGTTGCGGGACTTA－3′）。以乳酸桿菌基因組DNA為模板，利用引物擴(kuò)增1024bp的基因片段，將PCR產(chǎn)物送中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。應(yīng)用DNA Star軟件中的MegAlign將擴(kuò)增序列與Gen－Bank中 的 L.aviarius DSM20655 （登陸號(hào)M58808）、L.brevis ATCC14869（登陸號(hào) M58810）、L.mali DSM20444（登陸號(hào) M58824）、L.crispatus DSM20584 （登 陸 號(hào) Y17362）、L.fermentum ATCC14931（登陸號(hào) M58819）、L.plantarumJCM 1149（登陸號(hào) D79210）、L.acidophilus ATCC4356（登陸號(hào) M58802）和L.salivarius ATCC11741（登陸號(hào)AF089108）的16SrRNA基因進(jìn)行同源性分析。

1.2.5 乳酸菌生物學(xué)特性試驗(yàn)

1.2.5.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 待測(cè)菌株MRS液體培養(yǎng)基38℃下活化3代。取培養(yǎng)24h的菌液，以2%接菌量接入22支5mL／支的MRS液體培養(yǎng)基中，另取22支5mL／支的MRS液體培養(yǎng)基做空白對(duì)照。38℃下溫箱靜置培養(yǎng)54h，分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、42、48、54h取1支試管和1支空白對(duì)照測(cè)定OD600值和pH。

1.2.5.2 pH 測(cè)定 用梅特勒－托利多精密pH 計(jì)測(cè)量上述不同時(shí)間段所取菌液的pH。

1.2.6 14號(hào)菌株與標(biāo)準(zhǔn)嗜酸乳桿菌抑菌活性對(duì)比把前期分離的抑菌活性最強(qiáng)的14號(hào)菌株，與文獻(xiàn)中報(bào)道抑制致病性大腸埃希菌活性最強(qiáng)的嗜酸乳桿菌進(jìn)行抑菌活性比較，試驗(yàn)選用的嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分自豬直腸。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株形態(tài)特征和牛津杯法篩選結(jié)果

8個(gè)樣品分離純化得到35株疑似乳酸菌，牛津杯法篩選后保留2株，分別為11號(hào)和14號(hào)。菌落形態(tài)均為淡黃色，中等大小，圓形，中央稍隆起，表面光滑，邊緣不整齊，半透明；菌體形態(tài)均為革蘭陽(yáng)性，兩端鈍圓，無(wú)芽胞桿菌，細(xì)長(zhǎng)，稍彎曲，單個(gè)、兩個(gè)或一線排列。

經(jīng)牛津杯法初篩，35株分離菌淘汰23株沒(méi)有抑菌環(huán)的菌株。經(jīng)牛津杯法復(fù)篩，剩余12株菌保留2株抑菌環(huán)最大的菌株（11號(hào)和14號(hào)）。結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

2.2 生化鑒定結(jié)果

2.2.1 乳酸菌屬的鑒定 乳酸菌屬的鑒定結(jié)果見(jiàn)表2，11、14號(hào)菌株為革蘭陽(yáng)性無(wú)芽胞桿菌，觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)均為陰性，不液化明膠，不產(chǎn)生吲哚和硫化氫，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，鑒定其為乳酸桿菌屬[7]。

2.2.2 乳酸桿菌的種間鑒定 種間鑒定結(jié)果見(jiàn)表3，11號(hào)除不發(fā)酵甘露醇外，其他性質(zhì)符合唾液乳桿菌，14號(hào)菌性質(zhì)完全符合唾液乳桿菌。

2.3 分子鑒定結(jié)果

用10g／L的瓊脂糖凝膠對(duì)試驗(yàn)菌株的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物做電泳檢測(cè)，植物乳桿菌做陽(yáng)性對(duì)照。經(jīng)核酸染料染色后，在1000bp處出現(xiàn)熒光條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。

菌株11、14號(hào)的16SrDNA序列與GenBank／EMBL／DDBJ中8個(gè)乳桿菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較（圖3）。11號(hào)、14號(hào)與唾液乳桿菌（L.salivarius）的同源性分別為99.3%，99.4%，它們之間同源性為99.9%。這與生化鑒定結(jié)果一致，判定11號(hào)、14號(hào)菌株為唾液乳桿菌[11－12]。

圖1 牛津杯法復(fù)篩Fig.1 The second screening of Oxford cup method

表1 12株疑似乳酸菌對(duì)3株致病大腸埃希菌的抑菌直徑（M±SD）Table1 Bacteriostatic annulus diameters of 12strains suspected Lactobacillus inhibit 3strains of pathogenic Escherichia coli（M±SD）

表2 乳桿菌屬的鑒定結(jié)果Table2 The identification results of genus Lactobacillus

表3 乳桿菌的種間鑒定結(jié)果Table3 The identification results of genus Lactobacillus

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Identification results of PCR

2.4 乳酸菌生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸性能的測(cè)定

由圖4和圖5可以看出，11號(hào)和14號(hào)菌株均在20h～22h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)曲線較一致，而且2株菌產(chǎn)酸性能均比較好，最低pH為3.22。

圖3 11號(hào)和14號(hào)菌株16SrDNA序列同源性分析Fig.316 SrDNA homology analysis of strains No.11and No.14

圖4 乳桿菌培養(yǎng)物pH隨培養(yǎng)時(shí)間變化曲線Fig.4 The changes of Lactic acid bacteria pH along with the culture time

圖5 乳桿菌培養(yǎng)物OD值隨培養(yǎng)時(shí)間變化曲線Fig.5 The changes of Lactic acid bacteria OD along with the culture time

綜合牛津杯法，生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸性能的測(cè)定，挑選14號(hào)菌株作為仔豬用微生態(tài)制劑優(yōu)良菌種。

2.5 14號(hào)菌株與標(biāo)準(zhǔn)嗜酸乳桿菌抑菌活性對(duì)比

取2株菌3代培養(yǎng)物的上清液做牛津杯抑菌試驗(yàn)（表4），結(jié)果14號(hào)菌抑菌效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，且差異顯著。

表4 乳桿菌對(duì)3株致病大腸埃希菌的抑菌直徑（M±SD）Table4 Bacteriostatic annulus diameters of Lactobacillus inhibit three strains pathogenic Escherichia coli（M±SD）

3 討論

由于豬腸道為厭氧環(huán)境，菌株的分離與純化全部在厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度以及培養(yǎng)基pH也盡量保證與仔豬腸道環(huán)境一致（38℃，近中性）這樣保證了分離的準(zhǔn)確性和減少菌株變異[13]。牛津杯法操作步驟繁瑣，要求操作者技術(shù)嫻熟、細(xì)致。本人總結(jié)前人操作，結(jié)合實(shí)驗(yàn)原理，并經(jīng)過(guò)摸索對(duì)牛津杯打孔法做了一些改進(jìn)和完善，力求更加精確，簡(jiǎn)便和重復(fù)性好。

（1）減少平皿用量，比如每個(gè)平皿可放7個(gè)牛津杯。這樣降低了誤差，節(jié)約2倍～3倍工作量，節(jié)省了試驗(yàn)耗材和時(shí)間。

（2）加樣后，放4℃擴(kuò)散12h，這樣能形成清晰抑菌環(huán)，否則抑菌環(huán)模糊且不易測(cè)量。

（3）為保證重復(fù)性，指示菌的活力、濃度、菌齡等每次盡量做到一致[14－15]。

本研究中牛津杯法篩選的指示菌為3株致病性大腸埃希菌（O8：K88、K87（B）、O149：K91、K88（ac）、O139：K82（B）：H1），分離源為豬，是引起仔豬黃白痢、仔豬水腫病、仔豬斷奶腹瀉等最主要的病原菌之一，這是分離抑菌效果良好菌株的關(guān)鍵。因?yàn)閺哪骋活悇?dòng)物分離到的乳酸菌只對(duì)這類動(dòng)物的消化道上皮表現(xiàn)出較強(qiáng)的黏附性，對(duì)其他動(dòng)物不黏附或低黏附，而這種黏附性是關(guān)系到微生物添加劑作用效果的關(guān)鍵問(wèn)題，這與Timmerman H M等[16]研究一致。而且通過(guò)3株豬源致病性大腸埃希菌篩選針對(duì)性更強(qiáng)。

牛津杯法篩選出抑菌效果最好的11號(hào)和14號(hào)菌株，經(jīng)生化鑒定和分子鑒定，符合唾液乳桿菌特性。綜合牛津杯法和生物學(xué)特性試驗(yàn)最終保留14號(hào)菌株，將14號(hào)菌株與文獻(xiàn)中抑制致病性大腸埃希菌優(yōu)良的一株豬直腸分離嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行抑菌對(duì)比，結(jié)果14號(hào)菌抑菌效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)菌株，為研究仔豬防腹瀉、促增長(zhǎng)的微生態(tài)制劑提供依據(jù)。

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