整合素干擾載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)

李維維，張彥明，王 剛，程 敏，陳 婷

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

整合素（integrin）是一種由α、β兩個(gè)亞單位組成的異源雙聚體跨膜蛋白，能傳遞跨膜信息、調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，在細(xì)胞黏附和增殖中起重要作用。整合素αvβ3是一類表達(dá)于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白黏附分子，由α和β兩種Ⅰ型膜蛋白亞單位以非共價(jià)鍵形式連接形成異源二聚體分子。整合素αvβ3在血管生成、胚胎發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫應(yīng)答等多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用[1－3]。αvβ3特異性識(shí)別配體的精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（RGD）三肽序列，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)（ECM）之間的相互作用，發(fā)揮其黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)兩大基本功能。

試驗(yàn)證明，整合素αvβ3是多種病毒的細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)。例如，Gavrilovskaya IN等研究表明整合素β3可促進(jìn)漢坦病毒致病毒株感染宿主細(xì)胞，并且與漢坦病毒所致疾病的血管通透性改變及血小板功能異常等致病機(jī)制有關(guān)[4－5]。Berinstein A等發(fā)現(xiàn)整合素是口蹄疫病毒的受體[6－8]。人雙?？刹《?、輪狀病毒、人免疫缺陷病毒等均可通過αvβ3介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞。但是整合素β3在豬瘟病毒感染中的作用一直鮮有研究，本研究通過RNA干擾的方法建立整合素β3的干擾載體并轉(zhuǎn)染豬血管內(nèi)皮細(xì)胞，為進(jìn)一步研究豬整合素β3在豬瘟病毒致病機(jī)理方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞 E.coli DH5α菌株、豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（SUVEC），由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院畜禽疫病防治與畜產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 MEM 培養(yǎng)基，GIBCOTM，Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS），Hyclone公司產(chǎn)品；胰蛋白酶，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；Trizol?Reagent，RT－PCR 試劑盒，Invitrogen公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒，威格拉斯公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BbsⅠ、T 4DNA連接酶及PCR反應(yīng)試劑、膠回收試劑盒反轉(zhuǎn)錄試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 10μL～1000μL微量加樣器，Eppendorf公司產(chǎn)品；PCR儀，美國(guó)Bio－Rad公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，Syngene公司產(chǎn)品；純水儀，Millopore公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本三洋公司產(chǎn)品；微波爐，海爾公司產(chǎn)品；8453型紫外分光光度計(jì)，Agilent公司產(chǎn)品；濾器、0.22μm混合纖維脂微孔濾膜，上海興亞凈化材料廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 干擾序列的設(shè)計(jì)及合成 從GenBank中查找豬整合素β3mRNA 基因（NM－214002.1），參考Gene Pharma Super Silencing shRNA干擾載體設(shè)計(jì)軟件，為保證干擾效果，設(shè)計(jì)了2個(gè)干擾起始的靶位點(diǎn)，分別是編碼區(qū)第976、1110位核苷酸位點(diǎn)。同時(shí)建立干擾載體的陰性對(duì)照。質(zhì)粒載體干擾序列兩端包含有BamHⅠ和BbsⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，所有DNA寡核苷酸片段均由上海吉瑪生物技術(shù)公司合成。

1.2.2 shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 以BamHⅠ和BbsⅠ酶切pGPU6／GFP／Neo質(zhì)粒載體使其線性化，將合成的寡核苷酸鏈制備退火雙鏈DNA，連接入經(jīng)BamHⅠ和BbsⅠ雙酶切的pGPU6／GFP／Neo質(zhì)粒載體。

1.2.3 轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞及質(zhì)粒的提取鑒定 在超凈工作臺(tái)中，取出感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化開，加入質(zhì)粒，輕彈混勻（避免劇烈振蕩），置冰上30 min，42℃熱激90s（需嚴(yán)格控制時(shí)間），立即置冰上2 min，加入800μL無抗生素LB培養(yǎng)基，200r／min振搖30min～60min。劃線于含卡那霉素的培養(yǎng)板，然后置37℃培養(yǎng)過夜（不超過16h）。挑取陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。質(zhì)粒提取使用威格拉斯公司的質(zhì)粒小提試劑盒完成，提取的質(zhì)粒進(jìn)行凝膠電泳鑒定條帶大小。同時(shí)進(jìn)行BamHⅠ單酶切鑒定。

1.2.4 質(zhì)粒濃度測(cè)定及細(xì)胞培養(yǎng) 紫外分光光度計(jì)在OD260nm和OD280nm測(cè)定質(zhì)粒濃度，為細(xì)胞轉(zhuǎn)染提供定量標(biāo)準(zhǔn)。豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（SUVEC）培養(yǎng)液為含100mL／L胎牛血清MEM培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2溫箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1d細(xì)胞傳代至六孔板，細(xì)胞密度以第2天鋪滿80%為宜。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光觀察 轉(zhuǎn)染試劑為脂質(zhì)體2000，按照說明書，六孔板的一孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染的DNA量為4μg，脂質(zhì)體2000的使用量為10μL。分別按照上述用量吸取質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體至EP管中，并用無血清的MEM培養(yǎng)液分別稀釋至250μL?；靹蚝笫覝胤胖?min，然后將兩者充分緩慢混合均勻，室溫放置30min。單層鋪滿80%的SUVEC棄掉原來培養(yǎng)液，加入1mL無血清的MEM培養(yǎng)液，再緩慢滴入脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA的混合液。輕柔混勻后置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2溫箱中孵育4h～6h后吸出混合液，并添加含100mL／L胎牛血清的MEM培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后24h、48h分別在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.2.6 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞用PBS洗3遍之后，用Trizol裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。細(xì)胞RNA電泳鑒定完整度之后，利用Takara公司的一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行細(xì)胞中cDNA的合成。反應(yīng)體系為20μL，加入總RNA 7μL，其他組分按照說明書加樣。反應(yīng)條件37℃，30min；95℃，5s。

1.2.7 豬整合素β3引物設(shè)計(jì)合成及PCR 從Gen－Bank中查找豬整合素β3mRNA基因（NM－214002.1），利用Primer5軟件設(shè)計(jì)合成β3的引物。引物序列為F：5′－CCATGATCGGAAGGAGTTTGCT－3′；R：5′－AAGGTGGATGTGGCCTCTTTATAC －3′。 引 物 序列由華大基因公司合成。利用Transgen公司的PCR試劑盒的SuperMix進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25μL，按照說明書加入PCR反應(yīng)混合液，并加入1μL的整合素β3的cDNA模板。

PCR退火溫度的摸索。設(shè)置梯度退火溫度，進(jìn)行PCR反應(yīng)，退火溫度梯度58.6、58、57、55.8、54.9、54.3℃，共6個(gè)梯度。摸索出的最優(yōu)反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延長(zhǎng)10min。12g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒凝膠電泳結(jié)果

提取的質(zhì)粒凝膠電泳后條帶在3000bp～5000bp之間，且無非特異性條帶出現(xiàn)（圖1），證明干擾載體質(zhì)粒是正確的。

圖1 干擾載體質(zhì)粒凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of recombinant interference plasmids

2.2 質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果

質(zhì)粒單酶切之后，線性片段DNA凝膠電泳條帶為5117bp（圖2），證明干擾載體擴(kuò)大培養(yǎng)后提取的質(zhì)粒正確無誤。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果

熒光顯微鏡照片（圖3）顯示，細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效果較理想，可達(dá)到50%左右。轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞熒光細(xì)胞量雖然比24h時(shí)稍多，但是細(xì)胞死亡較多，熒光強(qiáng)度沒有24h時(shí)明顯。

圖2 重組質(zhì)粒BamHI酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid digested by BamHⅠ

2.4 細(xì)胞RNA電泳結(jié)果

如圖4所示，提取的細(xì)胞RNA電泳顯示亞基條帶明顯，證明提取的RNA較完整。

2.5 整合素β3引物退火溫度摸索結(jié)果

如圖5所示，退火溫度為58.6℃的PCR產(chǎn)物條帶最亮，且非特異性擴(kuò)增較少?？紤]到退火溫度與PCR產(chǎn)物之間的關(guān)系，取58.6℃的整數(shù)，選擇59℃為最終的PCR退火溫度。

2.6 整合素β3的干擾效果

如圖6所示，在相同模板量，且PCR體系相同條件下，在1110干擾位點(diǎn)的干擾片段干擾效果最好，而在976位點(diǎn)的干擾位點(diǎn)相比較對(duì)照組，干擾效果不明顯。

圖3 熒光顯微鏡下的細(xì)胞轉(zhuǎn)染照片F(xiàn)ig.3 The transfected cells under the fluorescence microscope

圖4 豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染后提取的RNA電泳結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoresis of RNA extracted from transient transfected SUVEC

圖5 不同退火溫度下整合素β3的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.5 Agarose gel electrophoresis of integrinβ3PCR products using different annealing temperatures

圖6 整合素β3干擾效果凝膠電泳圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis for integrinβ3PCR products using the template from the transfected cells

3 討論

整合素β3亞基由2289個(gè)核苷酸組成（不包括信號(hào)肽），編碼762個(gè)氨基酸，包含692個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域，29個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和41個(gè)胞內(nèi)區(qū)，該蛋白富含半胱氨酸，共有56個(gè)半胱氨酸[9]。干擾載體是目前生物學(xué)領(lǐng)域研究比較常用的技術(shù)手段，用于在基因水平上干擾某些基因及位點(diǎn)的功能。shRNA是以PolⅠ或PolⅢ類啟動(dòng)子表達(dá)發(fā)夾狀siRNA，它可以通過載體整合到細(xì)胞基因組中，產(chǎn)生較持久的基因沉默效應(yīng)，但其整合可受載體局部結(jié)構(gòu)、細(xì)胞的特異性、細(xì)胞狀態(tài)等多種因素影響，因此有不同干擾效率[10]。用RT－PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染了干擾載體的細(xì)胞中整合素的干擾效果，結(jié)果表明，干擾載體在1110核苷酸片段處干擾效果最好，為進(jìn)一步研究豬瘟病毒在整合素β3表達(dá)量下調(diào)的細(xì)胞中的增殖奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)為去除載體本身對(duì)細(xì)胞的干擾作用，設(shè)定了空白載體對(duì)照組，即不能表達(dá)干擾片段的空載體，將其同步轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株，并轉(zhuǎn)染細(xì)胞。為確定轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒確實(shí)是我們?cè)O(shè)計(jì)好的含有干擾載體的質(zhì)粒，我們將提取的質(zhì)粒用凝膠電泳的方法檢測(cè)完整質(zhì)粒的條帶大小，結(jié)果顯示各個(gè)質(zhì)粒條帶清晰均一，且無雜帶出現(xiàn)，初步表明質(zhì)粒的純度和均一性很好。另外，利用載體中的BamHⅠ酶切位點(diǎn)進(jìn)行單酶切，判斷質(zhì)粒條帶大小，凝膠電泳顯示各條帶均在5117bp左右，與載體序列（5117bp）大小一致。為了最大程度的避免轉(zhuǎn)染效率的不同，我們?cè)谫|(zhì)粒提取之后用紫外分光光度法測(cè)定質(zhì)粒濃度，定量后以統(tǒng)一的質(zhì)粒量轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在24h及48h分別收取細(xì)胞，提取RNA。RTPCR后檢測(cè)干擾效果。

整合素在病毒上的作用的研究由來已久。1995年，Berinstein A 等[6]研究證明，口蹄疫病毒（FMDV）對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的感染可被αvβ3的抗血清和αvβ3的單克隆抗體阻斷，懷疑αvβ3是FMDV侵染細(xì)胞的受體之一。Neff S等[11]發(fā)現(xiàn)病毒與整合素αvβ3的結(jié)合依賴于FMDV中的RGD序列結(jié)構(gòu)，同時(shí)認(rèn)為整合素αvβ3可能是FMDV的受體。Guerrero C A 等[12]將vitronectin（透明連接蛋白，αvβ3的配體）和β3的單克隆抗體分別與MAl04細(xì)胞懸液孵育，再用RRV、nar3或 Wa 3種輪狀病毒分別感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不管是vitronectin還是β3的單克隆抗體，都可降低病毒感染率，但對(duì)病毒的吸附?jīng)]有影響。在體外，整合素αvβ3是漢坦病毒（Hantaan virus，HTNV）在內(nèi)皮細(xì)胞上的受體；在體內(nèi)，整合素αvβ3對(duì)HTNV的感染也很重要，但同時(shí)HTNV可能也需要β3以外的受體介導(dǎo)作用[3]。Raymond T等[13]發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3在非激活狀態(tài)下，漢坦病毒可與它的一個(gè)特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而病毒與這一結(jié)構(gòu)域的相互作用使得整合素αvβ3調(diào)整血管通透性的功能受到抑制?，F(xiàn)有的研究認(rèn)為整合素αvβ3可以是漢坦病毒屬病毒的感染受體，但除此以外是否還有其他分子的參與，仍有待進(jìn)一步深入研究。

唐青海等[14]研究發(fā)現(xiàn)，感染豬瘟病毒的豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中整合素β3表達(dá)量上調(diào)，為研究整合素β3與豬瘟病毒的相互作用提供了前期試驗(yàn)基礎(chǔ)。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了整合素β3的干擾載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，利用RT－PCR的方法檢測(cè)細(xì)胞中整合素β3的mRNA表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在1110位點(diǎn)的干擾片段干擾效果較佳。且干擾載體中帶有熒光標(biāo)記和篩選基因，為后續(xù)篩選陽(yáng)性細(xì)胞及進(jìn)行各方面檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

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