山東地區(qū)Ⅰ型鴨肝炎病毒分離鑒定及單克隆抗體的研制＊

提金鳳，李志杰，李 舫

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 261061）

鴨病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是由鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）引起的一種傳播快速、急性高度致死性傳染病，主要侵害1月齡以內(nèi)的雛鴨。該病于1949年由Levine和Hofstad首次發(fā)現(xiàn)于美國的長島，呈世界性分布，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一[1]。鴨病毒性肝炎的病原為DHV，可分為3個血清型，分別為Ⅰ型DHV、Ⅱ型DHV和Ⅲ型DHV[1－2]。DHV屬于小RNA病毒科，病毒粒子呈正二十面體結(jié)構(gòu)，其組成為衣殼蛋白和一條由衣殼蛋白包裹的長約7.7kb左右的單鏈正股RNA組成。Ⅰ型DHV流行最廣泛且致病力最強(qiáng)，Ⅱ型DHV僅見于英國，Ⅲ型DHV 僅見于美國和中國，均呈偶發(fā)性[3－4]。

近年來，國內(nèi)外也相繼有關(guān)新型DHV （NDHV）的報道，但Ⅰ型DHV仍是發(fā)病的主要血清型。傳統(tǒng)上對該病的治療是采用卵黃抗體，但有時受卵黃抗體中非特異性蛋白或抗體滴度過低的影響，治療效果較差。針對這種情況，本文從山東地區(qū)分離出一株Ⅰ型DHV并進(jìn)行鑒定，然后對其進(jìn)行單克隆抗體的研制，篩選出具有中和性的單克隆抗體，為以后進(jìn)一步用單抗來進(jìn)行該病的臨床診斷和治療提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 雞胚、細(xì)胞系及實驗動物 SPF雞胚購自山東省農(nóng)科院家禽研究所；6周齡的Balb／c小鼠以及8周齡～10周齡的昆明鼠購自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院；小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0－Ag14由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心邵衛(wèi)星博士饋贈。

1.1.2 主要試劑 PEG4000、高糖型 DMEM、次黃嘌呤、胸腺嘧啶、L－谷氨酰胺、單克隆抗體亞類鑒定試劑盒、鄰苯二胺（OPD）、辣根過氧化物酶（HRP）為Sigma公司產(chǎn)品；羊抗鼠IgG－HRP、羊抗鼠IgGM－HRP為華美公司產(chǎn)品；氨基喋呤為GIBCO BRL公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離培養(yǎng) 從山東地區(qū)某鴨場（臨床診斷為鴨病毒性肝炎）采集發(fā)病鴨的肝臟，在勻漿器中加入適量滅菌的生理鹽水（一般按照1∶4的比例）后進(jìn)行勻漿，組織液12000r／min 10min離心，取上清液，加入青霉素和鏈霉素在4℃過夜。然后將上清液經(jīng)尿囊腔接種9日齡～11日齡的SPF雞胚10枚，0.2mL／枚，另設(shè)生理鹽水對照。37℃溫箱中培養(yǎng)，觀察5d～8d，并收集死亡胚的尿囊液[5]。

1.2.2 病毒的鑒定[6－7]

1.2.2.1 病毒中和試驗 按照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行。用滅菌生理鹽水稀釋收集獲得的疑似DHV尿囊液，稀釋至0.2mL病毒含量為200ELD50。取0.2mL與等量的Ⅰ型鴨肝炎病毒的陽性血清進(jìn)行混合，37℃水浴作用30min，然后接種10枚SPF雞胚，每只胚0.2mL，37℃溫箱培養(yǎng)，觀察5d～8d。

1.2.2.2 動物回歸試驗 將10只3日齡鴨肝炎病毒母源抗體陰性的雛鴨分為2組，5只／組。其中1組用獲得的疑似DHV尿囊液及死亡胚體的混合物，頸部皮下注射進(jìn)行攻毒，攻毒量為0.5mL／只；另1組設(shè)為對照組，頸部皮下注射生理鹽水，0.5mL／只。隔離飼養(yǎng)，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.2.3 RT－PCR鑒定 按照文獻(xiàn)[8－9]進(jìn)行。參考GenBank中已發(fā)布的血清型Ⅰ型DHV VP1基因序列，由寶生物工程（大連）有限公司合成引物。上游引物：5′－GAA TTC GGT GAT TCC AAC AGT TG －3′；下游引物：5′－GCG GCC GCT TCA ATT TCC AGA TTG－3′。劃線處分別為限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ的識別位點。

用RNA提取試劑盒提取RNA進(jìn)RT－PCR擴(kuò)增?；厥盏腜CR產(chǎn)物克隆至pMD18－T載體中，雙酶切法進(jìn)行陽性重組質(zhì)粒鑒定。最后由寶生物工程（大連）有限公司完成測序。

1.2.2.4 免疫原和檢測抗原的制備及鑒定 將已經(jīng)鑒定的Ⅰ型DHV接種100枚9日齡～11日齡的SPF雞胚，收集72h～96h死亡雞胚的尿囊液，并將收集的尿囊液進(jìn)行濃縮純化。方法如下：先將尿囊液在4℃以12000r／min離心10min，取上清液，將上清液與等量的氯仿震蕩混勻，在4℃ 以8000 r／min離心10min，取上清水相。然后將水相放在透析袋中4℃透析，透析液為50%的PEG4000。將透析后的濃縮液在4℃以12000r／min離心10min，取上清液。分光光度計測定DHV的濃度。

將純化后的抗原經(jīng)0.22μm濾器過濾后接種9日齡～11日齡的雞胚，并設(shè)正常雞胚作對照。記錄雞胚死亡及胚體病變情況。

1.2.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立

1.2.3.1 免疫動物 取6周齡的 Balb／c小鼠，腹部皮下注射已濃縮純化后的DHV，100μg／只，每隔2周免疫接種1次，第3次免疫接種后1周，眶下竇采血，用間接ELISA測定小鼠血清的OD值，若為陽性，1周后加強(qiáng)免疫1次，3d后融合。

1.2.3.2 融合 按照文獻(xiàn)[10]方法，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的SP2／0細(xì)胞按3∶1的比例，用PEG4000誘導(dǎo)融合。

1.2.3.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選及其克隆化 采用間接ELISA法進(jìn)行篩選，將檢測為陽性的孔中的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，及時凍存，同時按照有限稀釋法進(jìn)行亞克隆至陽性率為100%，并制備腹水。

1.2.4 單克隆抗體特性的鑒定

1.2.4.1 亞類鑒定 用亞類鑒定試劑盒，采用抗原介導(dǎo)的ELISA 法（Atigen－Mediated ELISA），按其說明書所介紹的方法進(jìn)行測定。

1.2.4.2 效價測定 取已定株的雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清和其腹水做倍比稀釋，間接ELISA進(jìn)行測定。

1.2.4.3 單克隆抗體特異性鑒定 用雞胚尿囊液、DPV、EDS－76V、IBV、MDV 及 NDV等抗原點樣，用Dot－ELISA檢測所制備的單克隆抗體的反應(yīng)性。

1.2.4.4 雞胚中和特性測定 采用固定病毒－稀釋單抗法進(jìn)行中和特性鑒定。用滅菌生理鹽水稀釋已鑒定的DHV尿囊液，稀釋至0.2mL病毒含量為200ELD50。取0.2mL與等量的1∶5、1∶10、1∶50稀釋的單抗進(jìn)行混合，37℃水浴作用30min，然后接種SPF雞胚，每個稀釋度接種4枚雞胚，37℃溫箱培養(yǎng)，觀察5d～8d。另設(shè)生理鹽水空白對照和病毒對照組。然后將單抗分別與本實驗室已分離鑒定的7株Ⅰ型DHV（其中3株分離自濰坊地區(qū)、4株分離自濟(jì)南地區(qū)）進(jìn)行中和試驗，并記錄試驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離鑒定

10枚SPF雞胚均在接種后72～96h之間死亡，死亡的胚體水腫出血，尤其是頭部、翅膀和腿部點狀出血明顯。剖檢發(fā)現(xiàn)有的肝臟邊緣白色壞死，有的肝臟上白色點狀壞死呈斑駁狀，有的肝臟發(fā)綠且邊緣壞死。收集死亡雞胚的尿囊液。

病毒中和試驗結(jié)果表明，該分離毒株能被Ⅰ型鴨肝炎病毒的陽性血清中和。動物回歸試驗顯示攻毒組雛鴨在72h內(nèi)死亡率達(dá)100%，病死鴨主要表現(xiàn)角弓反張、剖檢肝臟出血、膽囊充盈、充滿茶色膽汁，腎臟腫脹、出血；對照組健康無變化。

2.2 RT－PCR鑒定

用RNA提取試劑盒提取RNA，并利用設(shè)計的引物進(jìn)行Ⅰ型DHV VP1基因擴(kuò)增，獲得714bp大小的基因片段（圖1）?；厥盏腞T－PCR產(chǎn)物克隆至pMD18－T載體中，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ進(jìn)行酶切鑒定（圖2）。最后由寶生物工程（大連）有限公司完成測序。

2.3 免疫原和檢測抗原的制備及鑒定

將濃縮純化后的Ⅰ型DHV經(jīng)分光光度計測定其蛋白質(zhì)濃度，濃度為5mg／mL。

將純化后的抗原經(jīng)0.22μm濾器過濾后接種9日齡～11日齡的雞胚，并設(shè)正常雞胚作對照。雞胚在72h～96h之間死亡，死亡的胚體水腫出血，肝臟上有白色壞死點，沒有接種抗原的對照組雞胚發(fā)育正常。

圖1 Ⅰ型DHV VP1基因的RT－PCR產(chǎn)物Fig.1 RT－PCR products of DHV typeⅠ VP1gene

2.4 雜交瘤細(xì)胞株的建立

用間接ELISA方法，獲得了一株針對Ⅰ型DHV的單抗雜交瘤細(xì)胞株，命名為3B2。傳代培養(yǎng)后，依然能穩(wěn)定分泌單抗。

2.5 單克隆抗體特性的鑒定

圖2 重組質(zhì)粒pMD－VP1的酶切結(jié)果Fig.2 Enzyme digestion of recombinant pMD－VP1

2.5.1 單克隆抗體的部分生物學(xué)特性 3B2單抗的亞類鑒定為IgG1，細(xì)胞上清與小鼠腹水的ELISA效價分別為1∶500和1∶100000。

2.5.2 單抗特異性及廣譜性鑒定 本試驗所獲得的單抗與雞胚尿囊液、DPV、EDS－76V、IBV、MDV和NDV等均不反應(yīng)，特異性好。該單抗與本試驗分離的7株Ⅰ型DHV均反應(yīng)，具有一定的廣譜性。2.5.3 中和特性鑒定 本試驗所獲得的單抗中和特性較好，能以該雜交瘤細(xì)胞上清的原倍中和雞胚，并且和本試驗分離的其他7株Ⅰ型DHV均能發(fā)生中和反應(yīng)，廣譜性較好，結(jié)果見表1、表2。

表1 單抗3B2細(xì)胞上清與DHV的Dot－ELISA反應(yīng)結(jié)果Table1 Result of Dot－ELISA between the monoclonal antibody 3B2and DHV

表2 單抗3B2細(xì)胞上清與DHV中和反應(yīng)結(jié)果Table2 Result of neutralization action between the monoclonal antibody 3B2and DHV

3 討論

本研究通過雞胚分離培養(yǎng)和各種鑒定，獲得了一株Ⅰ型DHV。

DHV粒子的大小只有20nm～40nm，純化較困難，參考楊萍萍等對DHV的純化方法來濃縮純化該病毒。該方法主要是利用DHV對脂溶劑不敏感，能耐受反復(fù)凍融，對外界環(huán)境的抵抗能力強(qiáng)等特點進(jìn)行。通過處理，去除了絕大部分脂類和雜蛋白。濃縮后的DHV經(jīng)測定病毒含量較高，雜質(zhì)較少，可以作為制備單抗的免疫原和篩選抗原。由于作者所在實驗室條件所限，無法對濃縮后的DHV利用層析法或其他方法進(jìn)一步純化，這可能會為單抗的篩選帶來一定難度。再者，對病毒進(jìn)一步純化有可能會影響病毒的生物活性和病毒的結(jié)構(gòu)，這會 破壞病毒的免疫性，可能篩選不到具有中和性的單抗。因此，關(guān)于DHV更好的純化手段有待于進(jìn)一步的研究[11]。

陳溥言等首先報道國內(nèi)抗鴨肝炎病毒單抗的制備，之后楊萍萍等也做了報道[11]，但兩者所制備的DHV單抗中和特性較差，限制了該單抗的應(yīng)用。本研究旨在利用純化后的病毒制備出具有中和特性的Ⅰ型DHV單抗。本研究的純化抗原中可能會存在雞胚尿囊液中的一些雜蛋白，進(jìn)行單抗篩選時我們采用了雙篩選法，即用DHV純化抗原和正常雞胚尿囊液抗原同時包被酶標(biāo)板進(jìn)行同步檢測；為了獲得具有中和特性的單抗，對篩選到的陽性克隆先進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后先進(jìn)行中和試驗鑒定，對具有中和性的雜交瘤克隆再進(jìn)行亞克隆和保存。這樣就大大增加了獲得中和性單抗的概率。

本研究獲得了一株雜交瘤細(xì)胞株3B2，該雜交瘤細(xì)胞株上清液能中和病毒，具有較好的中和特性，且與本試驗分離的其他7株Ⅰ型DHV均能發(fā)生中和反應(yīng)，廣譜性較好；而且該株雜交瘤的穩(wěn)定性和特異性較好，為該單抗應(yīng)用于實驗室對Ⅰ型DHV檢測、DHV病毒檢測試劑盒的制備以及對DVH的抗病毒治療等提供重要的生物試劑。

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