腦心肌炎病毒及其蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究進展＊

凡靜靜，馮若飛，馬忠仁＊

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030）

腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）是一種重要的人畜共患病病原，屬于微RNA 病毒科心病毒屬（Cardiovirus）[1]。病毒粒子呈圓形，無囊膜，核衣殼呈二十面體對稱，直徑約為27nm～30nm，分子質(zhì)量約2600ku，在氯化銫中的浮密度為1.33g／cm3～1.34g／cm3。具有血凝性，可凝集綿羊紅細胞，可以抵抗乙醚、氯仿、乙醇等脂溶性溶劑，電離輻射、酚和甲醛可使此病毒失去活性，但病毒對熱有一定抵抗力，60℃加熱1h可被滅活，置－70℃可長期保存，對胰蛋白酶敏感性有所不同，二價陽離子對病毒沒有明顯的保護作用[2]。

1945年，Helwig FC等[3]從佛羅里達州一只患急性致死性心肌炎的黑猩猩體內(nèi)首次分離得到該病毒，1958年在巴拿馬首次證實EMCV是豬的一種致死性疾病的病原[4]。EMCV能夠引起豬產(chǎn)生急性病毒性傳染病，對非人靈長類動物的心肌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脾臟等產(chǎn)生急性或持續(xù)性感染，并且具有體外感染人心肌細胞的能力[5]。豬感染后，機體對外排毒及病毒血癥的時間極短，僅在感染后1d～3d可以從血清、鼻拭子、肛拭子中分離到病毒[6]。機體內(nèi)病毒存留的時間也很短，僅可在感染后1d～5d死亡仔豬的心、扁桃體、肝、腎和肺等組織器官中分離到病毒[7]，給病毒的分離帶來一定的困難。由于其宿主廣泛，不僅可以給養(yǎng)豬業(yè)造成經(jīng)濟損失，而且能夠跨種間傳播，對人構(gòu)成潛在危害。有研究不僅在人類血清中檢測到了EMCV抗體，而且還從熱性病患者體內(nèi)分離到了病毒[8]。因此，EMCV是重要的人獸共患病致病因子。論文對該病毒基因結(jié)構(gòu)和功能的研究進行了綜述。

1 腦心肌炎病毒基因組結(jié)構(gòu)及編碼蛋白特征

EMCV為單股正鏈RNA病毒，全長約7.8kb，包括5′UTR、3′U TR和中間一個較大的開放讀碼框 （ORF），5′端包含709nt，3′端包含137nt，ORF長為6879nt，編碼由2292個氨基酸組成的多聚蛋白。該多聚蛋白在3種蛋白酶的作用下被逐步分解，首先分解成前體蛋白P1、P2、P3和一個病毒自身編碼的引導(dǎo)蛋白或L蛋白，最終切割成11個蛋白終產(chǎn)物：P1區(qū)的VP1～VP4、P3區(qū)的3A～3D和P2區(qū)的2A～2C、病毒自身編碼的前導(dǎo)蛋白（L蛋白）[9]。

P1區(qū)核苷酸序列由1A、1B、1C和1D4個基因編碼序列組成，分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP4、VP2、VP3和 VP 1，分子質(zhì)量依次為8、28、25、30ku。這4種結(jié)構(gòu)蛋白組成了病毒的衣殼粒子，每60個衣殼粒子組成病毒的衣殼，是病毒抗原位點的所在，且以VP1的免疫原性最強。

P2及P3區(qū)核苷酸序列主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括2A、2B、2C、2D、3A、3B及蛋白酶3C和 RNA依賴性聚合酶3D，與病毒基因組的復(fù)制關(guān)系密切[10]。研究表明，非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)比結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)保守，而且1987年之后分離的豬源EMCV非結(jié)構(gòu)蛋白中3D最為保守、2A變異最大，結(jié)構(gòu)蛋白中VP2最為保守、VP1變異最大[1]。

EMCV轉(zhuǎn)錄機制獨特，其5′末端沒有 “帽子”結(jié)構(gòu)，由20個氨基酸組成的 VPg充當(dāng)病毒的“帽子”，5′UTR區(qū)域較大，包括1個特殊結(jié)構(gòu)——內(nèi)部核糖體進入位點 （internal ribosomal entry site，IRES）。IRES由大約450個堿基組成，其作用是引導(dǎo)病毒基因組不經(jīng)過正常的5′“帽子”末端結(jié)構(gòu)而直接進行多聚蛋白的翻譯[11]。在近5′端有Poly（C），長度約50nt～150nt。3′UTR是復(fù)制酶的第一結(jié)合位點，其二級結(jié)構(gòu)在病毒的翻譯與復(fù)制過程中具有重要作用，該區(qū)是病毒復(fù)制酶識別并結(jié)合的位點，主要起始負鏈RNA的合成。3′UTR在病毒的翻譯過程及感染性病毒粒子的形成過程中起著十分重要的作用[12]。

2 EMCV結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白的功能

結(jié)構(gòu)蛋白擁有抗原表位，常用于基因工程疫苗研究，非結(jié)構(gòu)蛋白與病毒的復(fù)制、核定位及感染等有關(guān)。EMCV的4種結(jié)構(gòu)蛋白均參與病毒抗原表位的形成，VP1是最重要的中和性抗原表位。受選擇性壓力的影響，VP1需要不斷發(fā)生變異以維持EMCV的存活。EMCV的主要抗原表位均位于VP1和VP3蛋白，同時已發(fā)現(xiàn)，VP3／VP1結(jié)合區(qū)是EMCV變異相對較大的區(qū)域[13]。

VP1還與病毒粒子表面的拓撲結(jié)構(gòu)、抗原性、受體吸附及脫殼有關(guān)[14]。VP1蛋白刺激小鼠產(chǎn)生的多克隆抗體具有中和活性，可以中和EMCV在小鼠體內(nèi)的感染能力，表明VP1蛋白是EMCV重要的保護性抗原。VP1基因核苷酸突變導(dǎo)致所編碼氨基酸的變異可造成病毒血凝活性的喪失、病毒受體結(jié)合位點的改變，從而導(dǎo)致EMCV在致糖尿病型和非糖尿病型之間的轉(zhuǎn)變[15]，表明VP1基因?qū)MCV的致病性發(fā)揮重要作用。EMCV衣殼蛋白VP1第100位氨基酸能夠通過影響病毒在感染小鼠腦中的復(fù)制，特別是在神經(jīng)細胞中的復(fù)制，從而影響EMCV對小鼠的致病性[16]。

VP2上存在的2個B細胞線性表位，有一定的免疫活性。VP3與病毒的細胞嗜性高度相關(guān)，也散存著一些抗原表位。VP4基因處于病毒結(jié)構(gòu)蛋白的最內(nèi)側(cè)，抗原性最弱。

病毒非結(jié)構(gòu)蛋白主要是編碼蛋白加工相關(guān)蛋白和病毒基因組復(fù)制相關(guān)蛋白。EMCV的2A蛋白含有150個氨基酸，參與自動催化和病毒多聚蛋白的早期裂解。病毒多聚蛋白合成后，首先由2A蛋白酶將蛋白水解成P1和P2＋P3，再由3C蛋白酶將P1、P2和P3分別水解成單體1A、1B、1C、1D，2A、2B、2C和3A 、3B、3C、3D。EMCV感染時2A蛋白能抑制宿主細胞mRNAs帽子結(jié)構(gòu)依賴性翻譯的能力。這一抑制機制與2A病毒蛋白和游離的40S緊密結(jié)合但卻不出現(xiàn)在80S聚集區(qū)有關(guān)。同時病毒的2A蛋白含有許多酵母核糖體蛋白都有的核定位信號，2A蛋白的缺失還阻止了病毒的核定位。Donnelly G D等[17]經(jīng)研究報道，2A蛋白酶通過裂解翻譯起始因子的eIF4G亞基，從而改變能與帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合的4E－EP1翻譯抑制體的活性來抑制宿主細胞內(nèi)的蛋白合成，抑制宿主細胞的翻譯，這在病毒的起始加工過程中具有重要的作用，還對病毒RNA的復(fù)制起作用。L蛋白和2A蛋白協(xié)同作用，是病毒基因組產(chǎn)生抵抗宿主的防御特性[18]。

2B蛋白可以改變細胞膜，增加細胞膜的滲透性，這可能對病毒感染晚期病毒粒子的釋放具有重要的作用。

2C基因參與病毒基因組的復(fù)制，其表達產(chǎn)物2C蛋白具有良好的免疫原性。2C和前體蛋白2BC對細胞內(nèi)膜的重排、病毒誘導(dǎo)的細胞質(zhì)囊泡的形成是必需的[19]。2C蛋白具有ATP酶活性，雖含有螺旋酶基序，但是不具有螺旋酶的活性。麥芽糖結(jié)合蛋白－2C融合蛋白具有ATP酶和GTP酶活性并能與 RNA 結(jié)合[20－21]。

3A（分子質(zhì)量為10ku）是一個核心蛋白，對小RNA病毒逃避宿主的免疫反應(yīng)具有重要的作用，且這種作用與病毒毒力和宿主范圍有關(guān)。

3B蛋白（即VPg蛋白）是共價結(jié)合于正鏈和負鏈RNA 5′末端的蛋白引物。前體蛋白3AB可促進病毒RNA聚合酶3D的活性和促進3CD的自身切割。

3C和3CD病毒蛋白酶具有多重功能，與病毒RNA的結(jié)合、蛋白加工處理和RNA的復(fù)制過程相關(guān)。3C蛋白是在病毒加工處理過程和RNA復(fù)制中產(chǎn)生的重要蛋白，它具有一個半胱氨酸作為親核作用的活性位點，其結(jié)構(gòu)與糜蛋白酶樣色氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)相似[22]。3C和它的前體3CD在病毒蛋白的水解過程中發(fā)揮著主要作用。在被2A蛋白羧基末端附近的多肽段催化后，3C蛋白幾乎參與了病毒蛋白的所有后期水解過程。經(jīng)初級切割后，病毒蛋白3C（和3CD前體蛋白）對病毒蛋白前體進行二級切割。首先3C蛋白自身從P3前體蛋白切割下來，然后在P2－P3前體蛋白間進行重要的加工處理，切割產(chǎn)生病毒復(fù)制蛋白。

3D基因是EMCV的重要基因，編碼RNA聚合酶，可以催化引物介導(dǎo)的反應(yīng)中新生RNA鏈的延長，在病毒聚合酶復(fù)合物中發(fā)揮重要的作用。而且3D基因高度保守。1990年之后分離到的豬源EMCV其核苷酸同源性達到99%以上，因此可以根據(jù)3D基因序列設(shè)計RT－PCR引物用于檢測EMCV[23]，作為免疫和感染動物的鑒別診斷抗原。

L蛋白由70個氨基酸組成的引導(dǎo)蛋白，其內(nèi)部的“鋅指”基序能夠穩(wěn)定空間構(gòu)象調(diào)控病毒mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯[28]。Mengo病毒的L蛋白可以抑制由于病毒感染而引起的應(yīng)激顆粒的堆積，表明L蛋白對應(yīng)激顆粒有頡頑作用[24]。

3 5′UTR的功能及特性

EMCV內(nèi)部核蛋白體進入位點（internal ribosomal entry site，IRES）是位于其基因組5′端非翻譯區(qū)的順式作用序列，能夠在一些反式作用因子的輔助下，招募核糖體小亞基到mRNA的翻譯起始位點，而不通過掃描機制尋找合適的翻譯起始密碼子，即介導(dǎo)核蛋白體不依賴mRNA 5′端7甲基鳥嘌呤核苷酸（m7G）帽的蛋白質(zhì)合成起始機制[25]。

復(fù)雜穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)是維持IRES元件活性的關(guān)鍵因素。有研究表明修飾EMCV的GNRA（G代表鳥嘌呤、N代表任意核苷酸、R代表嘌呤、A代表腺嘌呤）基序都能使其翻譯活性大大降低，同時穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)也是IRES元件活性所必需的。宿主翻譯相關(guān)因子與莖環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合促使IRES構(gòu)象發(fā)生改變，使其與核糖體復(fù)合物能夠結(jié)合，從而使得翻譯起始并得以順利進行。

IRES序列的擴增要求完整、準確，才能有效啟動EMCV的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生具有感染性的RNA，EMCV的IRES末端序列對其IRES的活性影響極大[26]。IRES表達模式可較好地用來研究雙基因或多基因的表達以及某些病毒基因與宿主細胞相互作用機制[26]，已經(jīng)進入實踐應(yīng)用的如Clontech公司開發(fā)的pIRES2質(zhì)粒[27]，它可以表達增強型綠色熒光蛋白 （EGFP），應(yīng)用較為廣泛。

4 3′UTR的功能及特性

小RNA基因組的末端具有非編碼區(qū)（UTR），是病毒基因組復(fù)制的主要調(diào)控位點。3′非編碼區(qū)（3′UTR）是復(fù)制酶的第一結(jié)合位點，其二級結(jié)構(gòu)在病毒的翻譯與復(fù)制過程中具有重要作用，該區(qū)是病毒復(fù)制酶識別并結(jié)合的位點，主要起始負鏈RNA的合成。3′UT R在病毒的翻譯過程及感染性病毒粒子的形成過程中起著十分重要的作用[12]。

3′UTR可能與病毒抗原演化和病毒感染動物的嗜性有關(guān)，而內(nèi)部的基序則成為起始復(fù)合物形成或維持空間構(gòu)象的某些蛋白因子的結(jié)合平臺[12]。3′UTR有PolyA的尾巴，它與病毒的RNA依賴性RNA聚合酶的結(jié)合過程有關(guān)。

5 展望

血清學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，我國普遍存在EMCV的感染，針對病毒致病機制、基因特征和預(yù)防技術(shù)的研究逐漸成為該病毒的研究的熱點。目前，其結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2等和非結(jié)構(gòu)蛋白2C、3AB被選作為主要研究對象。對病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能的研究能加深對該病毒的了解，有望更加深入地研究病毒特征并能篩選有效的目標(biāo)基因，研究建立疾病早期診斷的檢測方法，獲得有效的預(yù)防以及治療性疫苗，探索阻斷病毒傳播的有效途徑。

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