Rho/ROCK信號(hào)通路與青光眼

宋海珊，高殿文

(1.中國(guó)人民解放軍 202醫(yī)院 眼科，遼寧 沈陽(yáng) 110003； 2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院 眼科，遼寧 沈陽(yáng) 110004)

青光眼是世界范圍內(nèi)首要的致盲性眼病之一。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡是青光眼神經(jīng)病變的最終通路。引起青光眼視神經(jīng)病變的關(guān)鍵因素是眼壓升高，目前的治療方法主要是通過(guò)藥物或手術(shù)降低眼壓。由于單純降低眼壓并不能完全阻止神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及軸突的進(jìn)行性變性損害，因此，尋求保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其軸突的青光眼視神經(jīng)保護(hù)治療也越來(lái)越引起人們的重視，在相關(guān)領(lǐng)域開(kāi)展了許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)取得有意義的研究成果，包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、凋亡抑制劑、谷氨酸拮抗劑、NO合成酶抑制劑、鈣通道阻滯劑、抗氧化劑、疫苗等[1-2]，但都還缺乏有說(shuō)服力的證據(jù)證明臨床有效。

Rho屬于小分子單聚體GTPases超家族，是Ras超家族的哺乳動(dòng)物基因同系物，通過(guò)其下游最主要的效應(yīng)分子Rho激酶或ROCK(Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase)，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的重組，從而廣泛參與細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞骨架調(diào)整、肌肉細(xì)胞收縮、神經(jīng)再生、腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等一系列生物學(xué)過(guò)程[3-4]。越來(lái)越多的研究表明：RhoA/ROCK激酶信號(hào)通路參與了青光眼的發(fā)病機(jī)制，在降低眼壓、保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及改善眼部血流量方面為青光眼的治療顯示了良好的前景，特異性RhoA/ROCK阻斷劑可能成為青光眼治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

1 Rho/ROCK信號(hào)通路的基本概念

自1985年首次發(fā)現(xiàn)Rho(ras homologous)基因以來(lái)[5]，人們對(duì)其基因產(chǎn)物Rho及其信號(hào)傳導(dǎo)通路Rho/ROCK進(jìn)行了廣泛的研究。人Rho亞家族分子量約為20～30 kD，由氨基酸序列高度同源的3種異構(gòu)體組成： RhoA、RhoB和RhoC，目前研究較為清楚的是RhoA。它含有高度保守的GDP/GTP結(jié)合區(qū)和GTP酶活性區(qū)，此外還具有靶區(qū)和膜定位結(jié)構(gòu)。Rho蛋白以活化的Rho-GTP形式和非活化的Rho-GDP形式兩種狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中[6]。Rho受多種細(xì)胞因子的調(diào)控，使Rho完成兩種狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換。活化的Rho-GTP作用于其下游的多種底物，產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。

ROCK是Rho下游最主要的效應(yīng)分子[7]，稱為相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase)，簡(jiǎn)稱為Rho激酶或ROCK。ROCK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其分子結(jié)構(gòu)包括氨基端的催化結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)合Rho的α卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和羧基端的催化結(jié)構(gòu)域以及Cys/His區(qū)。活化的Rho- GTP通過(guò)與ROCK的α卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域結(jié)合，暴露ROCK的催化中心，激活ROCK。Rho激酶有兩種同源性極高的異構(gòu)體：ROCK I和ROCK II。

ROCK I主要在非神經(jīng)組織中表達(dá)，包括心臟、肺和骨骼肌；ROCK II主要在大腦、脊髓等神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。兩種異構(gòu)體在眼小梁組織、睫狀體中都有表達(dá)[8]。

ROCK激活后，可以作用于多種底物，產(chǎn)生不同的生物學(xué)過(guò)程。其中，肌球蛋白輕鏈(MLC)和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)是兩種最主要的底物。肌球蛋白輕鏈MLC的磷酸化水平是決定平滑肌收縮程度的一個(gè)重要因素。MLCK磷酸化MLC的Ser-19 位點(diǎn)，導(dǎo)致平滑肌收縮；MLCP的抑制可以使MLC的磷酸化和平滑肌的收縮進(jìn)一步增強(qiáng)。ROCK被激活以后，本身可以將MLC磷酸化而發(fā)生肌絲收縮作用；同時(shí)也能將MLCP磷酸化，使MLCP失活，導(dǎo)致細(xì)胞胞漿內(nèi)MLC磷酸化程度增高，間接促進(jìn)肌絲收縮，而Rho或ROCK抑制劑可以抑制MLCP的活性，增強(qiáng)平滑肌的擴(kuò)張[7]。

2 Rho/ROCK通路對(duì)眼壓的影響

目前，治療青光眼的方法主要是降低眼壓。而眼壓的增高是由于房水流暢率的下降或房水流出阻力的增高所致。通過(guò)降低房水流出道的阻力、增加房水流出易度來(lái)降低眼壓已引起越來(lái)越多的關(guān)注。

2.1 房水的小梁引流途徑

房水由睫狀突上皮細(xì)胞分泌，主要通過(guò)小梁途徑流出眼外，人眼的小梁房水流出系統(tǒng)包括：小梁網(wǎng)、Schlemm氏管和房水靜脈。小梁網(wǎng)從眼內(nèi)到眼外的方向又分為葡萄膜小梁、角鞏膜小梁和鄰管組織(juxtacanalicular conneetive tissue, JCT)。房水經(jīng)葡萄膜小梁、角鞏膜小梁和鄰管組織，經(jīng)Schlemm氏管內(nèi)皮細(xì)胞上的孔，進(jìn)入Schlemm氏管管腔，再經(jīng)過(guò)集合管開(kāi)口流入集合管和房水靜脈，最終流入眼表。這一途徑中Schlemm氏管和鄰管組織是房水流出阻力最大的區(qū)域[9-10]，因而成為青光眼降眼壓治療的新靶點(diǎn)。

2.2 小梁組織的收縮特性及對(duì)房水引流的影響

小梁細(xì)胞具有平滑肌細(xì)胞樣的一些特性，如：小梁細(xì)胞表達(dá)平滑肌細(xì)胞激動(dòng)蛋白、肌球蛋白、離子通道和G蛋白藕聯(lián)受體(GPCR)；另外，一些生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和藥物均可以改變小梁細(xì)胞的收縮和舒張狀態(tài)[11]。研究顯示，小梁組織收縮時(shí)，細(xì)胞去極化、細(xì)胞內(nèi)鈣增加，導(dǎo)致房水流出減少；小梁組織舒張時(shí)，細(xì)胞超極化，max-K通道被激活、L型鈣通道的關(guān)閉，導(dǎo)致房水外流增加[12]。由于小梁組織具有平滑肌特性，而平滑肌的收縮程度主要由MLC的磷酸化水平?jīng)Q定，促使人們?cè)O(shè)法通過(guò)Rho/ROCK信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)MLCP的活性，改變MLC的磷酸化水平，從而改變小梁組織收縮和舒張狀態(tài)，增加房水經(jīng)小梁途徑引流[11 ]。

2.3 Rho對(duì)房水引流的影響

人眼小梁細(xì)胞、Schlemm氏管均表達(dá)RhoA。研究發(fā)現(xiàn)：通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段增加眼前節(jié)Rho GTPase抑制劑-C3胞外酶的表達(dá)、抑制Rho GTPase的活性可使小梁細(xì)胞發(fā)生形狀和結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白壓力纖維和細(xì)胞間粘附減少，使細(xì)胞內(nèi)MLC磷酸化水平下降，增加房水流出易度，促進(jìn)房水外流[13]。他汀類降膽固醇藥物可以間接降低Rho GTPase的活性，也表現(xiàn)出增加房水的流出易度、降低眼壓的作用[14]。而激活Rho-GTPase卻顯示出相反的作用： 如用內(nèi)皮素-1等Rho-GTPase激動(dòng)劑可以增加細(xì)胞間粘附和肌動(dòng)蛋白壓力纖維，使MLC磷酸化水平提高，降低了灌注眼球的房水流出易度[15]。

2.4 ROCK抑制劑與房水引流

小梁組織和睫狀體均表達(dá)ROCK。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示：通過(guò)局部滴藥、前房注射或玻璃體腔注射等方式給予ROCK抑制劑后(包括Y- 27632、Y- 39983及fasudil)，均可以迅速降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的眼內(nèi)壓[16-18]。 ROCK抑制劑的降壓作用與阻斷ROCK后使小梁房水流出道松弛、導(dǎo)致房水引流增加密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Y-27632，H-1152及fasudil等ROCK的抑制劑能阻斷Carbacol和內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的小梁及睫狀體的收縮，使小梁組織細(xì)胞間隙擴(kuò)大，減少細(xì)胞內(nèi)actin纖維及細(xì)胞間局部粘附形成[19-20]。Lu Z等[21]采用牛眼進(jìn)行灌注實(shí)驗(yàn)，觀察Y-27632對(duì)鄰管區(qū)結(jié)構(gòu)的影響及對(duì)房水流出易度的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，Y- 27632治療眼鄰管區(qū)明顯擴(kuò)張，房水流出易度增加。因此，ROCK抑制劑有望成為一種有潛力的待開(kāi)發(fā)的降眼壓藥物。

3 Rho/ROCK通路與視神經(jīng)保護(hù)

青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其軸突的緩慢、進(jìn)展性的變性，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。在有效控制眼壓的基礎(chǔ)上，尋求神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)是青光眼治療的方向。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，阻斷Rho/ROCK信號(hào)通路顯示出令人興奮的神經(jīng)保護(hù)作用，為青光眼的視神經(jīng)保護(hù)提供了思路。

3.1 Rho/ROCK通路與中樞神經(jīng)元的保護(hù)

腦及脊髓損傷后，存在大量髓源性神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子，如Nogo-A、髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin- associated glycoprotein，MAG)、少突膠質(zhì)細(xì)胞- 髓鞘相關(guān)糖蛋白(oligodendrocyte- myelin glycoprotein，OMgp)、以及LINGO-1等。這些抑制因子通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)Rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路引起肌動(dòng)蛋白骨架的重組和軸突生長(zhǎng)錐的塌陷，從而阻斷軸突再生過(guò)程，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡[22-23]，而阻斷Rho活性或阻斷其下游效應(yīng)分子ROCK均可以解除抑制促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)[24]。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用ROCK抑制劑Fasudil可顯著改善大鼠脊髓外傷的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元恢復(fù)，在急性期表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用，使組織損傷減輕、軟化灶縮小，在恢復(fù)期觀察到損傷部位神經(jīng)纖維生長(zhǎng)明顯增強(qiáng)[25]。

3.2 Rho/ROCK通路與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)

在青光眼的發(fā)病過(guò)程中，谷氨酸毒性、一氧化氮毒性、營(yíng)養(yǎng)因子中斷、血管異常、缺血再灌注損傷等均參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的過(guò)程。青光眼鼠動(dòng)物模型中，可發(fā)現(xiàn)髓源性生長(zhǎng)抑制因子LINGO-1表達(dá)上調(diào)，RhoA活性增加[26]。在視神經(jīng)擠壓傷動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用Rho阻斷劑C3-07可以促神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的再生，增加視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活[27]。Kitaoka[28]證實(shí)ROCK阻斷劑fasudil在NMDA所致的視網(wǎng)膜神經(jīng)毒性中顯示出神經(jīng)保護(hù)作用。這些研究提示，Rho/ROCK通路阻斷劑對(duì)保護(hù)青光眼神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活方面具有潛在作用。

4 Rho/ROCK通路對(duì)眼內(nèi)血流量的影響

缺血因素在青光眼的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[29]，改善眼的血液灌注成為青光眼治療的一個(gè)新方向。大量研究顯示，Rho- GTPase和ROCK的抑制劑能夠舒張高血壓患者血管內(nèi)皮細(xì)胞下的平滑肌，減輕血管痙攣，增加機(jī)體血液灌注。ROCK抑制劑還可以降低眼內(nèi)壓并增加局部眼血流量[30]。應(yīng)用Rho-GTPase和ROCK抑制劑來(lái)增加眼部的血流量可能有助于青光眼的治療。

5 小 結(jié)

Rho/ROCK信號(hào)通路參與了青光眼的發(fā)病過(guò)程，在青光眼降眼壓治療、抗RGC凋亡、增加視網(wǎng)膜血液灌注等方面顯示出令人鼓舞的潛力，特異性RhoA/ROCK阻斷劑可能成為青光眼治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)，為抗青光眼治療提供新的思路。

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