PSMA靶向性小分子谷氨酸尿素類似物Glu-urea-Lys的合成

陳驍馳，楊德勇，車翔宇，王建伯，陳 峰，宋希雙

(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧大連 116011)

PSMA靶向性小分子谷氨酸尿素類似物Glu-urea-Lys的合成

陳驍馳，楊德勇，車翔宇，王建伯，陳 峰，宋希雙

(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧大連 116011)

［目的］探索前列腺特異性膜抗原(PSMA)靶向性谷氨酸尿素小分子的合成。［方法］按照標準的無水無氧操作技術進行實驗操作;應用核磁共振光譜儀與高分辨質(zhì)譜儀進行化合物成分測定分析。［結果］經(jīng)核磁共振波普法與質(zhì)譜法分析，確認得到以谷氨酸尿素為結構基礎的小分子化合物Glu-urea-Lys。［結論］以Glu-urea-Lys為基礎結構的研究，將為前列腺癌分子影像學診斷及靶向治療領域提供理論依據(jù)與實驗基礎。

PSMA;Glu-urea-Lys;前列腺癌

前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)是位于前列腺上皮細胞表面的II型跨膜糖蛋白。PSMA在正常前列腺以及前列腺增生細胞表面有所表達，在絕大多數(shù)前列腺癌細胞中其表達明顯上調(diào)［1］。PSMA具有葉酸水解酶及N-乙酰基化α-連接的酸性二肽酶 (NAALADase)活性，能夠通過網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞機制產(chǎn)生內(nèi)化效應。雖然PSMA調(diào)控前列腺癌惡性表型的分子機制尚不明確，與前列腺癌侵襲、轉移、分期、分級等臨床參數(shù)之間的關系仍有爭議，但PSMA在前列腺癌細胞表面特異性高表達的生物學特征及內(nèi)化效應，使其在前列腺癌分子影像學及靶向治療領域具有極為重要的研究價值［2］。已有研究表明，核素等物質(zhì)標記的PSMA單克隆抗體在前列腺癌的分子影像學診斷及靶向治療方面顯示出一定的臨床應用前景［3-4］。然而，PSMA 單克隆抗體屬于大分子蛋白類物質(zhì)，對前列腺癌腫瘤實質(zhì)，尤其對淋巴結轉移以及骨轉移前列腺癌的滲透性差，循環(huán)半衰期長，與非特異性組織結合后清除速度慢，體內(nèi)應用副作用較大，容易引起免疫應答反應，而且單克隆抗體生產(chǎn)成本高，保存過程中生物活性容易發(fā)生改變，因此限制了其在前列腺癌診斷及治療中的應用。

為了改進前列腺癌的診斷及治療方法，近年來研究人員開發(fā)出一系列PSMA靶向性小分子物質(zhì)，可以特異性作用于前列腺癌細胞。谷氨酸尿素小分子及其類似物(Glu-urea-R)是葉酸水解酶I活性抑制劑，同時能夠競爭性抑制PSMA的NAALADase酶活性，因此能夠高效、靶向的與前列腺癌細胞表面的PSMA相結合，并且通過內(nèi)化作用進入到前列腺癌細胞內(nèi)。在Glu-urea-R的空間結構中，Gluurea為PSMA綁定端，R基團為其它化學基團偶聯(lián)端。與PSMA的單克隆抗體相比，Glu-urea-R生物學活性穩(wěn)定，體內(nèi)循環(huán)半衰期短，對于腫瘤實質(zhì)以及腫瘤轉移灶滲透性好，體內(nèi)應用副作用低。研究表明，某些生物制劑與分子影像學顯象劑可以與Glu-urea-R結合，靶向作用于前列腺癌細胞，例如脂質(zhì)體、反義核苷酸、免疫與蛋白制劑、治療性siRNA、核素等。作為PSMA靶向性的小分子物質(zhì)，Glu-urea-R具有便于合成及純化、易于連接其它物質(zhì)、易溶于水、能夠穩(wěn)定儲存等特點。Gluurea-R在前列腺癌分子影像學及靶向治療方面具有極高的應用價值，目前國內(nèi)尚缺乏PSMA靶向性谷氨酸尿素小分子研制的報道。本文以賴氨酸(Lys)替換R集團，探討Glu-urea-Lys的合成。

1 材料和方法

1.1 分子篩

用于干燥有機溶劑的4A或5A分子篩，必須先經(jīng)過活化:將其在馬弗爐中400℃煅燒4 h，然后置于干燥器中冷卻至室溫備用。

1.2 溶 劑

將二氯甲烷先經(jīng)過5A分子篩浸泡后，在高純氮氣的保護下，以CaH2作為除水劑，加熱回流6 h。常壓蒸出，保存于Schlenk瓶中備用。

1.3 實驗儀器

1.3.1 核磁共振光譜儀:Varian INOVA 400 MHz核磁共振光譜儀:化學位移(δ)單位為ppm，耦合常數(shù)(J單位為Hz。峰形表示為:s=單峰，d=雙峰，t=三重峰，m=多重峰，br=寬峰。

1.3.2 高分辨質(zhì)譜:液相色譜/四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀:HPLC/Q-Tof MS(英國 Micromass公司)。雙正交設計的ZSprayTM大氣壓電離源，四級桿質(zhì)量過濾器，Q-Tof分析器。電噴霧離子源，操作正離子模式。

1.4 實驗路線

見式1。

式1 目標化合物的合成路線Scheme 1 synthetic route to the title compound

1.5 實驗方法

如沒有特殊說明，本實驗操作均在無水無氧條件下，按照標準的Schlenk技術規(guī)范進行。

將固體光氣(290 mg，1 mmol)用無水二氯甲烷(6 mL)溶于裝有恒壓漏斗的三口圓底燒瓶中，形成懸濁液，并將反應液冷卻至0℃。

在恒壓漏斗中加入溶有化合物1(1.008 g，2.7 mmol)和 N，N - 二異丙基乙胺(1.3 mL，7 mmol)的二氯甲烷((5 mL)溶液。

保持反應液0℃，將恒壓漏斗中的溶液滴加到三口瓶中，50 min左右滴加完畢，繼續(xù)攪拌30 min。

將化合物2(0.8 g，2.7 mmol)和 N，N - 二異丙基乙胺(1.04 mL，6 mmol)的二氯甲烷(5 mL)溶液，一次性加入到三口瓶中，保持0℃繼續(xù)攪拌30 min。

反應液用30 mL水稀釋，二氯甲烷(3×30 mL)萃取，有機相用50 mL飽和食鹽水洗滌，并用無水硫酸鈉干燥得到黃色油狀物，柱層析(石油醚∶乙酸乙酯 =5∶1至2∶1)分離，得到白色固體化合物3;所得化合物3經(jīng)核磁共振波普法與質(zhì)譜法進行成分分析測定。

將化合物3(1.32 g，2.13 mmol)溶于乙醇(15 mL)中，加入甲酸銨(1.32 g，10 eqv.)于反應液中，然后加入Pd-C(10%，260 mg)，室溫攪拌過夜至完全。反應液用硅藻土過濾后，濾餅用乙醇洗(4×8 mL)，濃縮得到粗產(chǎn)物1.07 g。柱層析(二氯甲烷∶甲醇 =30∶1至8∶1)分離，得到油狀物化合物4。所得化合物4經(jīng)核磁共振波普法與質(zhì)譜法進行成分分析測定。

2 結 果

化合物3(1.37 g，82%)，作為最終產(chǎn)物4的原料，性狀為白色固體，為了確定化合物3的結構的正確性，對其進行了核磁共振波譜分析和高分辨質(zhì)譜分析。其中氫原子(H)核磁共振波譜的數(shù)據(jù)如下:氫-核磁共振(1H NMR)(400兆赫茲(MHz)，氘代氯仿(CDCl3))δ 7.40 -7.27(m，5H)，5.37 -5.30(m，3H)，5.11(d，J=10.2 Hz，2H)，4.38 -4.31(m，2H)，3.19 -3.14(m，2H)，2.31 -2.25(m，2H)，2.06 -2.03(m，1H)，1.90 -1.40(m，34H)(圖1)。液相色譜/四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀對分子結構的質(zhì)量分析，高分辨質(zhì)譜(ESMS)顯示為:質(zhì)核比(m/z)為:622(M+H)+。

從1H NMR可以看出，分子中有 51個氫。1.40-1.90處中有27個氫是化合物3中的叔丁基的特征峰;7.27-7.40處出現(xiàn)的5個氫，屬于芐基芳環(huán)的氫;5.11處出現(xiàn)的氫為芐基碳上面的氫;而4.31-4.38 與 3.14 -3.19 處的峰為結構中與氮(N)相連的碳上面的氫，這種氫相對于其他非鄰近N的碳上面的氫，化學位移要往低場移一些;N上面的氫的峰出現(xiàn)在5.30-5.37處。

通過高分辨質(zhì)譜，測出產(chǎn)物的分子量為622，液相色譜/四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀的電離源為電噴霧離子源，電離方式為軟電離，這樣必須額外加上一個氫的正電荷，才能在液質(zhì)聯(lián)用的質(zhì)譜中出峰，所以實際的分子量為621。

綜合1H NMR和高分辨質(zhì)譜的測試，可以確定合成出的化合物3正確。

化合物4(550 mg，53%)，為油狀物，為了確定化合物3的結構的正確性，對其進行了核磁共振波譜分析和高分辨質(zhì)譜分析。其中H核磁共振波譜的數(shù)據(jù)如下:1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 4.32-4.29(m，2H)，3.08 -3.01(m，4H)，2.84 -2.80(m，2H)，2.35 -2.29(m，2H)，2.08 -2.06(m，1H)，1.86 -1.42(m，34H)(圖2)。液相色譜/四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀對分子結構的質(zhì)量分析，高分辨質(zhì)譜(ESMS)顯示為:m/z:488(M+H)+。

從1H NMR可以看出，分子中有 45個氫。1.42-1.86處中有27個氫是化合物4中的叔丁基的特征峰;在原料化合物3中，7.27-7.40處出現(xiàn)的5個氫和5.11處出現(xiàn)的氫在化合物4的譜圖中均消失了，證明反應確實是脫掉了氨基上面的芐基，脫掉芐基正是這一步反應的目的;3.01-3.08處出現(xiàn)的4個氫為分子中氨基上面的氫;而4.29-4.32與3.01-3.08處的峰為結構中與氮(N)相連的碳上面的氫。

通過高分辨質(zhì)譜，測出產(chǎn)物的分子量為488，液相色譜/四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀的電離源為電噴霧離子源，電離方式為軟電離，這樣必須額外加上一個氫的正電荷，才能在液質(zhì)聯(lián)用的質(zhì)譜中出峰，所以實際的分子量為487。

綜合1H NMR和高分辨質(zhì)譜的測試，可以確定合成出的化合物4正確。

圖1 化合物3的1H-NMR譜圖Fig 1 The1H-NMR spectra of compound 3

圖2 化合物4的1H-NMR譜圖Fig 2 The1H-NMR spectra of compound 4

3 討 論

前列腺癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，在男性人群中前列腺癌是僅次于肺癌的第二常見腫瘤，占男性惡性腫瘤的10%［5］。前列腺癌微病灶的早期發(fā)現(xiàn)及腫瘤靶向治療對患者的存活率有著深遠影響。盡管傳統(tǒng)影像學方法(B超、CT、MRI)的靈敏性與精確度取得了長足的進步，但是仍然較難對早期微小前列腺癌作出明確的診斷;臨床上更缺乏前列腺癌靶向性化療藥物的應用。近年來，PSMA靶向性谷氨酸尿素小分子及其類似物在前列腺癌分子影像學診斷及靶向治療中的作用正日益受到關注。

Maresca等［6］設計、合成了若干易于被核素123I，131I標記的Glu-urea-R，并認為R基團以及與其偶聯(lián)底物的化學性質(zhì)可以顯著影響Glu-urea-R與 PSMA的親和力。Kularatne等［7］將 Gluurea-R與99mTc-Dap-Asp-Cys螯合物進行偶聯(lián)得到可能用于SPECT診斷前列腺癌的分子影像學探針;而將Glu-urea-R與化療藥物TubH相結合可以在體外細胞實驗中殺死PSMA陽性表達的LNCaP細胞。Zhang等［8］將 Glu-urea-R 與 DNP偶聯(lián)，通過Glu-urea端靶向識別前列腺癌，通過DNP端募集體內(nèi)免疫殺傷相關抗體以期望對前列腺癌起到靶向免疫治療的作用。研究表明Glu-urea-R中的R集團可以被不同的氨基酸所替代，例如以谷氨酸尿素酪氨酸為結構基礎的［125I］DCIT，以谷氨酸尿素半胱氨酸為結構基礎的［11C］DCMC與［18F］DCFBC，以谷氨酸尿素賴氨酸為結構基礎的［99mTc］L1等，這些小分子物質(zhì)都對PSMA顯示出高特異性與親和力。由于許多生物制劑與分子影像學顯象劑能夠通過ε氨基與Lys-C(O)-Glu結構相連接，因此以Lys替換Glu-urea-R中的R集團在前列腺癌分子影像學診斷及靶向治療領域中有著廣闊的研究前景。

目前，國內(nèi)尚缺乏PSMA靶向性谷氨酸尿素小分子及其類似物研制的報道。本課題組應用固體光氣等原料，在無水無氧條件下，按照標準的Schlenk技術規(guī)范操作，最終得到油狀物化合物，經(jīng)核磁共振波普法與質(zhì)譜法分析，確認此物質(zhì)為目的化合物Glu-urea-Lys;研究表明，在 Glu-urea-R結構中，當R基團含有第三羧基時，Glu-urea-R能夠高親和性的綁定到PSMA的活性位點，而Lys可以提供自由的第三羧酸官能團，因此Glu-urea-Lys小分子能夠靶向性與PSMA相結合。根據(jù)Gluurea-Lys易于連接其他化學基團的結構特點及其能夠靶向性綁定前列腺特異性膜抗原PSMA的分子生物學屬性，本課題組在今后的實驗中將以此為基礎，應用正電子核素標記Glu-urea-Lys，探索高靈敏性、高特異性的前列腺癌PET/CT分子探針的合成方法，研究其對前列腺癌PET/CT的成像特征;并進一步將Glu-urea-Lys從分子影像學延伸至前列腺癌基因、藥物靶向治療領域，為前列腺癌的早期診斷，術前分期，術后復發(fā)再分期，前列腺癌的靶向治療以及靶向治療患者的選擇、療效評估與監(jiān)測提供新的策略。

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Synthesis of PSMA-targeted small molecule Glu-urea-Lys analogue

CHEN Xiao-chi，YANG De-yong，CHE Xiang-yu，WANG Jian-bo，CHEN Feng，SONG Xi-shuang
(Department of Urinary Surgery，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116011，China)

Abstract:［Objective］To search for the synthetic method of PSMA-targeted small molecule Glu-urea-Lys analogue.［Methods］All reactions are carried out in dry glassware under an atmosphere of anaerobic conditions for experimental operation.We use nuclear magnetic resonance spectrometer and high-resolution mass spectrometer to analyze the ingredients of compound.［Results］We get the confirmed compound through nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectrography.［Conclusion］The studies based on Glu-urea-Lys will offer the experimental and theoretical basis for the molecular iconography diagnosis and targeted therapies of prostate cancer.

Key words:PSMA;Glu-urea-Lys;prostate cancer

R34

A

1671-7295(2012)01-0013-05

國家自然科學基金項目(30670544)

2011-12-16;

2011-12-20

陳驍馳(1981-)，男，遼寧錦州人，博士研究生。

宋希雙，教授。E-mail:song-xishuang@163.com