小檗堿對(duì)人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞增殖和凋亡的影響

黃勤杰 施超 朱健

小檗堿是從我國傳統(tǒng)中藥黃連、黃柏中提取的一種生物堿，研究表明小檗堿有抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞系增殖和遷移的作用［1－3］。本研究通過小檗堿作用于人肝癌細(xì)胞系 SMMC-7721細(xì)胞株，探討其對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 鹽酸小檗堿購于中國藥品生物制品檢定所。溶于120 mmol/L的 HEPES調(diào)節(jié)液(pH值7.4)中，配制成100 μg/ml的儲(chǔ)備液，超濾除菌，－20℃保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞株由南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科陸彬彬饋贈(zèng)，在含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，傳代保存。對(duì)照組為加入RPMI 1640培養(yǎng)液的SMMC-7721 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組為分別加入 10、20、40、60 μg/ml的小檗堿的SMMC-7721細(xì)胞。

1.3 MTT法 取對(duì)數(shù)生長期各組細(xì)胞接種于96孔板，每孔1 ×103個(gè)細(xì)胞，取 6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組分為 10、20、40、60 μg/ml 4個(gè)濃度，分別培養(yǎng) 0、24、48、72 h 后加 MTT(5 mg/ml)20 μl/孔，37℃，5%CO2。孵箱中繼續(xù)孵育 4 h，棄上清，加 DMSO 150 μl/孔，振蕩20 min，使結(jié)晶充分溶解，在490 nm波長的酶聯(lián)儀上檢測(cè)各組的A值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 流式細(xì)胞分析 2組的MMC-7721細(xì)胞各培養(yǎng)48 h，經(jīng)胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，PBS洗1次，70%冷乙醇固定，DAPI染色，上樣于流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.5 軟瓊脂克隆形成試驗(yàn) 2組的MMC-7721細(xì)胞各培養(yǎng)24 h，將1.2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×1640等體積混合，取1 ml鋪于24孔板，室溫下使其凝固待用。將0.7的低熔點(diǎn)瓊脂糖與含5組SMMC-7721細(xì)胞的2×1640等體積混合，取1 ml鋪于頂層，每組做6個(gè)復(fù)孔，每孔含500個(gè)細(xì)胞。待頂層瓊脂凝固后，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)2周，觀察5組細(xì)胞克隆形成情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用方差分析對(duì)各組細(xì)胞周期和軟瓊脂克隆形成率進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法 4組細(xì)胞的生長曲線，可見小檗堿對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用隨時(shí)間延長和劑量增加而增加。見圖1。

圖1 4組細(xì)胞的生長曲線

2.2 流式細(xì)胞分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡 在對(duì)照組和小檗堿:0 μg/ml組中未檢測(cè)到明顯亞二倍體峰，小檗堿10～60 μg/ml組均檢測(cè)到典型的亞二倍體峰，隨小檗堿劑量增加，亞二倍體峰面積明顯增加，細(xì)胞凋亡率增加。見表1、圖2。

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率%，±s

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率%，±s

注:與小檗堿 0 μg/ml比較，*P ＜0.01

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圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)5組細(xì)胞凋亡率

2.3 軟瓊脂克隆形成試驗(yàn) 低倍鏡下計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞以上的克隆:鹽酸小檗堿各濃度組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說明小檗堿對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的克隆形成能力隨藥物濃度增加而增加。見表2。

表2 5組細(xì)胞軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)n=6，%，±s

表2 5組細(xì)胞軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)n=6，%，±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.01

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3 討論

肝癌是目前我國發(fā)病率和病死率均居前列的惡性腫瘤，雖然目前手術(shù)及介入已經(jīng)提高了肝癌的生存時(shí)間，但晚期肝癌目前治療效果比較差，需要我們尋找新的治療方法。

中藥是我國的傳統(tǒng)瑰寶，在其中有許多對(duì)惡性腫瘤有效的藥物，而且目前研究天然植物抗腫瘤藥物成為當(dāng)今國際醫(yī)藥界的重點(diǎn)方向［4，5］。

小檗堿是從我國傳統(tǒng)中藥黃連、黃柏中提取的一種生物堿，研究表明小檗堿可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡［6］，同時(shí)小檗堿也可以抑制乳腺癌細(xì)胞系 MCF-7和MDA-MB-231的生長［7］。有研究顯示小檗堿抑制惡性腫瘤的增殖與Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)［8］。

本研究結(jié)果表明小檗堿對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞增殖有抑制作用，該作用隨小檗堿的濃度和作用時(shí)間的增加而增加，同時(shí)小檗堿也有促人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用，并隨小檗堿的濃度增加而增加。同時(shí)隨著小檗堿的濃度的增加，人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞克隆形成能力也出現(xiàn)下降。

綜上所述，鹽酸小檗堿可以抑制人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡，這提示小檗堿可能成為一種新的抗肝癌藥物。

1 Colombo ML，Bugatti C，Mossa A，et al.Cytotoxicity evaluation of natureal cop tisine and synthesis of cop tisine from Berberine.Farmaco，2001，56:403-409.

2 Orfila L，Rodriguez M，Colman T，et al.Structuralmodification of berberine alkaloids in relation to cytotoxic activity in vitro.J Ethnopharmacol，2000，71:449-456.

3 Iizuka N，Miyamoto K，Okita K，et al.Inhibitory effect of cop tidis rhizoma and berberine on the proliferation of human esophageal cancer cell lines.CancerLett，2000，148:19-25.

4 Kizaki H，Onishi Y.TopoisomeraseⅡ Inhibitor Induced apoptosis in thymocytes and lymphoma cells.Adv Enzyme Regul，1997，37:403-423.

5 Lee KH.Anticancer drug design based on plant derived natural products.J Biomed Sci，1999，6:236-250.

6 李國英，楊林西，王玉平，等.小檗堿對(duì)人胃癌細(xì)胞株BGC2823誘導(dǎo)凋亡的研究.中藥藥理與臨床，2005，21:16-18.

7 Kim JB，Lee KM，Ko EY，et al.Berberine inhibits growth of the breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231.Planta Med，2008，74:39-42.

8 何百成，康全，楊俊卿，等.小檗堿抗腫瘤作用與Wnt/β2catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系.中國藥理學(xué)通報(bào)，2005，21:1108-1111.