HPLC法同時(shí)測(cè)定人血漿中舍曲林與氯氮平的濃度Δ

劉偉忠，陳清霞，溫預(yù)關(guān)，王廣發(fā)（.廣州市腦科醫(yī)院國(guó)家藥品臨床研究基地，廣州50370；.中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 500；3.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 5050）

舍曲林（Sertraline）是一種選擇性的5-羥色胺（5-HT）再攝取抑制劑（SSRI），該藥通過(guò)對(duì)突觸前膜5-HT再攝取泵的強(qiáng)力抑制，促進(jìn)5-HT能神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞；與傳統(tǒng)的三環(huán)類抗抑郁藥不同，舍曲林在中樞的作用部位具有高度選擇性，對(duì)中樞的各種受體如乙酰膽堿受體、腎上腺素受體、組胺H受體均無(wú)阻滯作用，常用于強(qiáng)迫癥與抑郁癥的治療[1]。氯氮平（Clozapine）是一種非經(jīng)典抗精神病藥，其鎮(zhèn)靜作用強(qiáng)，具有強(qiáng)大的抗精神病效應(yīng)；對(duì)精神病陽(yáng)性和陰性癥狀均有良好療效，較少引起錐體外系反應(yīng)（EPS）[2]。臨床上，舍曲林與氯氮平常聯(lián)合用于抑郁癥、強(qiáng)迫癥及精神分裂癥陰性癥狀的治療[3～5]，特別對(duì)伴有陰性精神分裂的抑郁癥患者療效顯著。這是因?yàn)榫穹至寻Y陽(yáng)性癥狀與中腦邊緣系統(tǒng)多巴胺（DA）活性增強(qiáng)有關(guān)，而陰性癥狀與額前葉DA活性下降及5-HT機(jī)制有關(guān)。氯氮平具有拮抗5-HT受體作用，從而增強(qiáng)額葉皮質(zhì)及紋狀體DA活性，改善精神分裂癥陰性癥狀；而舍曲林是SSRI類藥中已知對(duì)細(xì)胞色素氧化酶影響最小的藥物之一，藥物相互作用很少，安全性高，是唯一對(duì)DA再攝取產(chǎn)生顯著的抑制作用而增強(qiáng)大腦額葉皮質(zhì)DA功能的藥物，具有抗焦慮、抗抑郁雙重作用，能增加患者的思維活性，可改善精神分裂癥患者的認(rèn)知功能，從而緩解陰性癥狀[5]。這2種藥物血藥濃度的單獨(dú)測(cè)定國(guó)內(nèi)、外均有報(bào)道[6～8]，但這些方法儀器成本太高，臨床普及受到限制。本試驗(yàn)以建立了一種簡(jiǎn)單、快速的高效液相色譜（HPLC）法，同時(shí)測(cè)定人血漿中舍曲林與氯氮平的濃度。

1 材料

1.1 儀器

1100 HPLC儀，包括G1322A在線脫氣機(jī)、G1315B二極管陣列紫外檢測(cè)器（DAD）、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1311A自動(dòng)調(diào)配器、G1316A可調(diào)柱溫恒溫箱和Agilent色譜化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）；XW-80A渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；BSA124S-CW電子分析天平（瑞士Sartorius公司）；MIKO12-24高速離心機(jī)（美國(guó)Hettich公司）；MILLI-Q超純水儀（法國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

舍曲林對(duì)照品（輝瑞制藥有限公司，批號(hào):95872017，含量＞99%）；氯氮平對(duì)照品（廣東彼迪藥業(yè)有限公司，批號(hào):20100306，含量＞99%）；內(nèi)標(biāo):地西泮（廣東省藥品檢驗(yàn)所，批號(hào):20060508，含量＞99%）；醋酸銨（廣東臺(tái)山粵僑試劑有限公司，批號(hào):20090125，含量＞98%）；提取劑:乙酸乙酯與二氯甲烷（廣州化學(xué)試劑廠，含量＞99%）；乙腈與甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:美國(guó)迪馬公司的DiamonsilTMC18反相柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:30 mmol·L－1醋酸銨-乙腈（22∶78）；流速:1.0 mL·min－1；柱溫:40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm；靈敏度為0.01 AUFS。

2.2 血漿樣品處理

取1.0 mL含舍曲林與氯氮平的血漿至10 mL具塞玻璃錐形離心管內(nèi)，精確加入1.0 mg·L－1內(nèi)標(biāo)液20μL，振蕩數(shù)秒。再加提取劑乙酸乙酯-二氯甲烷（80∶20）4.0 mL，密塞，渦旋振蕩3 min，于6 000 r·min－1的離心機(jī)內(nèi)離心4 min。吸取上清液至5 mL具塞玻璃錐形離心管中，然后置于真空干燥箱內(nèi)，40℃干燥至干。進(jìn)樣前加甲醇100μL快速振蕩數(shù)秒溶解殘?jiān)?，吸?5μL進(jìn)樣。

2.3 色譜分離情況

在本試驗(yàn)條件下，空白血漿、舍曲林與氯氮平對(duì)照品+空白血漿+內(nèi)標(biāo)以及精神病患者同服舍曲林與氯氮平后的血漿樣品，經(jīng)本法測(cè)定，得到的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

由圖1可知，內(nèi)標(biāo)物、舍曲林和氯氮平的色譜峰能完全分離，無(wú)明顯的內(nèi)生雜質(zhì)峰干擾，可見(jiàn)本方法具有較高的專屬性。內(nèi)標(biāo)物、氯氮平和舍曲林保留時(shí)間為4.46、5.03和5.84 min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

在7個(gè)10 mL具塞錐形離心管中分別加入不同濃度、相同體積（20μL）的舍曲林與氯氮平對(duì)照品溶液，真空抽干溶劑后，再加空白血漿1.0 mL，振蕩數(shù)秒，使舍曲林血漿濃度分別相當(dāng)于20.0、40.0、80.0、160.0、240.0、480.0、600.0 μg·L－1，氯氮平血漿濃度分別相當(dāng)于 50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1 000.0 μg·L－1，然后按“2.2”項(xiàng)下方法處理后，經(jīng)HPLC分析，測(cè)得藥物峰面積Ai、內(nèi)標(biāo)峰面積As，以Ai/As的值（X）為橫坐標(biāo)，以血漿樣品所對(duì)應(yīng)各點(diǎn)藥物濃度（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)加權(quán)（權(quán)重W＝1/X2）最小二乘法進(jìn)行線性回歸，分別得舍曲林、氯氮平曲線方程為:Y＝72.527X+1.39（r＝0.998 6）、Y＝43.758X+2.35（r＝0.999 3）。結(jié)果表明，舍曲林、氯氮平血藥濃度分別在20.0～600.0 μg·L－1、50.0～1000.0 μg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。當(dāng)信躁比（S/N）＝3時(shí)，舍曲林與氯氮平的檢測(cè)限可達(dá)到10.0 μg·L－1。

2.5 回收率及精密度試驗(yàn)[10]

按“2.4”項(xiàng)下方法取舍曲林低、中、高濃度（40.0、160.0、480.0 μg·L－1）和氯氮平低、中、高濃度（100.0、400.0、800.0 μg·L－1）含藥血漿樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法處理，經(jīng)色譜分析，以峰面積比較，計(jì)算回收率:舍曲林與氯氮平低、中、高濃度的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線所對(duì)應(yīng)點(diǎn)的峰面積之比為相對(duì)回收率；而與相同濃度未經(jīng)提取獲得的色譜峰面積之比為提取回收率。結(jié)果顯示，相對(duì)回收率均＞95%，提取回收率均＞70%。同時(shí)，在同日內(nèi)重復(fù)5次和1周內(nèi)重復(fù)5次測(cè)定其濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間RSD，結(jié)果表明，該方法符合生物樣品分析要求?；厥章始熬芏仍囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s ）Tab 1 Results of recovery and precision test（s±s ）

表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s ）Tab 1 Results of recovery and precision test（s±s ）

藥物舍曲林氯氮平加入量/μg·L-1 40.0 160.0 480.0 100.0 400.0 800.0日內(nèi)精密度（n＝5）實(shí)測(cè)濃度/μg·L-1 40.3 158.2 476.3 101.3 397.4 796.6 RSD/%7.63 6.21 5.78 7.41 6.85 4.47日間精密度（n＝5）實(shí)測(cè)濃度/μg·L-1 40.6 157.8 476.7 100.7 396.1794.6 RSD/%9.52 7.37 5.52 8.14 7.76 5.85相對(duì)回收率（n＝5）回收率/%100.30 97.49 96.95 101.50 98.16 97.74 RSD/%7.32 6.71 5.26 7.59 6.36 4.92提取回收率（n＝5）回收率/%75.12 73.75 71.65 77.56 74.35 72.19 RSD/%7.12 6.87 4.31 7.65 5.72 4.46

2.6 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.4”項(xiàng)下方法分別配制舍曲林低、中、高濃度（40.0、160.0、480.0 μg·L－1）和氯氮平低、中、高濃度（100.0、400.0、800.0μg·L－1）的3組18個(gè)樣品（雙樣），各于室溫（25～28℃）放置0、12 h和－20℃凍存1、14 d以及－20℃凍存1、3周后分別進(jìn)行色譜測(cè)定。結(jié)果顯示，RSD均＜10%，凍存樣品未發(fā)生藥物降解。

2.7 樣品的質(zhì)量控制

按“2.4”項(xiàng)下方法分別配制舍曲林低、中、高濃度（40.0、160.0、480.0 μg·L－1）和氯氮平低、中、高濃度（100.0、400.0、800.0 μg·L－1）36個(gè)血漿樣品，置于－20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?，作為質(zhì)控樣品。每次檢測(cè)血樣時(shí)，同時(shí)檢測(cè)質(zhì)控樣品，如果相對(duì)回收率均落在85%～115%（低濃度在80%～120%）之內(nèi)，即可認(rèn)為儀器檢測(cè)正常，否則須檢查整個(gè)操作過(guò)程及儀器原因。

3 討論

舍曲林與氯氮平結(jié)構(gòu)中都有苯環(huán)，紫外吸收明顯。吸取舍曲林與氯氮平對(duì)照品溶液在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)舍曲林在210 nm波長(zhǎng)處有一最大吸收峰，氯氮平在210、229、256 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收峰，因此本試驗(yàn)選擇210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。舍曲林與氯氮平血藥濃度單獨(dú)檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)、外已有報(bào)道[6～9]，相比之下，本試驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定人血漿中舍曲林與氯氮平濃度的方法，具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、專屬性好等特點(diǎn)，提取回收率＞70%，相對(duì)回收率接近100%，日內(nèi)、日間RSD均＜10%，符合臨床藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)原則關(guān)于生物樣品分析方法的基本要求，結(jié)果可靠。

在本試驗(yàn)的過(guò)程中，曾用30 mmol·L－1醋酸銨-甲醇（24∶76）作流動(dòng)相，也能使內(nèi)標(biāo)物和舍曲林、氯氮平有較好分離，但血漿中內(nèi)源性物質(zhì)干擾嚴(yán)重，很易引起基線漂移；后改用30 mmol·L－1醋酸銨-乙腈（22∶78）時(shí)，色譜峰很理想。另外在本試驗(yàn)過(guò)程中曾分別使用乙醚、正己烷、乙酸乙酯和三氯甲烷為提取劑，提取率都達(dá)不到要求，而且單采用乙酸乙酯提取時(shí)血漿容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。后改用乙酸乙酯-二氯甲烷（80∶20）作提取劑，提取率較理想，且避免了血漿乳化；采用此混合提取劑一次提取，后用甲醇定容進(jìn)行紫外色譜分析，所取血漿僅為1.0 mL，進(jìn)樣量15μL便達(dá)到試驗(yàn)要求，既提高了靈敏度又減少了樣品雜質(zhì)，保證色譜柱能進(jìn)行大量樣品的連續(xù)分析。

在臨床精神科，對(duì)于難治性精神分裂癥或情感障礙，單一用藥往往很難控制患者癥狀，而采用聯(lián)合用藥，治療效果顯著。由于抗精神病藥治療窗相對(duì)較窄，毒副作用大，因此對(duì)其進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM），尋找療效最佳、副反應(yīng)最輕的適宜血藥濃度，具有積極的臨床意義。同時(shí)，雖然氯氮平血藥濃度與患者臨床用藥劑量呈顯著正相關(guān)，但從病例資料看也存在一定程度上的個(gè)體差異，單一患者的治療劑量不一定適用于所有患者，應(yīng)密切監(jiān)控其血藥濃度，做到用藥劑量個(gè)體化[2]。舍曲林與氯氮平單個(gè)藥物的TDM國(guó)內(nèi)、外已有報(bào)道[6～9]，相比之下，本試驗(yàn)建立的同時(shí)測(cè)定2種藥物的HPLC法，并應(yīng)用于臨床監(jiān)測(cè)，實(shí)用性更優(yōu)越。

[1]Davis R，Wilde MI.Sertraline A pharmacoeconomic evaluation of its use in depression[J].Pharmacoeconomics，1996，10（4）:409.

[2]劉向榮，劉 文，戴迎春，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定人血清中氯氮平、奮乃靜和氟哌啶醇濃度[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（22）:1 917.

[3]楊 文，趙 勇，魯曉波.舍曲林并用氯氮平治療抑郁癥療效觀察[J].中國(guó)民康醫(yī)學(xué)雜志，2008，20（23）:2 864.

[4]莊 寧，李 荔，劉知源，等.舍曲林合并氯氮平治療強(qiáng)迫癥30例對(duì)照研究[J].中國(guó)民康醫(yī)學(xué)雜志，2009，21（17）:2 076.

[5]龔 茜，王 軍.氯氮平聯(lián)合舍曲林治療精神分裂癥陰性癥狀對(duì)照研究[J].臨床心身疾病雜志，2008，14（1）:23.

[6]朱運(yùn)貴，王 峰，肖軼雯.人血漿中舍曲林濃度的LC-MS測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38（7）:512.

[7]何麗娟，馮 芳，武 潔.LC-MS測(cè)定人血漿中鹽酸舍曲林的濃度及相對(duì)生物利用度[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2006，41（6）:448.

[8]Niederlander HA，Koster EH，Hilhorst MJ.High throughput therapeutic drug monitoring of clozapine and metabolites in serum by on-line coupling of solid phase extraction with liquid chromatography-mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2006，834（1）:98.

[9]周志凌，程澤能，李坤艷，等.HPLC-MS/ESI法同時(shí)檢測(cè)血漿中4種非典型抗精神病藥物[J].中南藥學(xué)，2004，2（4）:231.

[10]黃 璞，陳清霞，黃偉僑.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定人血漿中氯氮平、阿立哌唑濃度[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（15）:1 339.