烏飯樹樹葉多糖提取及純化工藝優(yōu)化研究

程素嬌 鄧璐璐 章海燕 夏肖肖

張 暉1 錢海峰1 齊希光1 王 立1，2

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214036；2.生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（江南大學(xué)），江蘇 無錫 214036）

烏飯樹是一種藥食兼用的傳統(tǒng)植物資源，在中國分布廣泛。烏 飯 樹 樹 葉 （Vaccinium Bracteatum Thunb.leave，VBTL）含有多糖、黃酮、花色苷類、多酚類、單寧類等多種有效成分，其提取物具有抗氧化［1］、抗癌防 癌［2］、抑菌［3］、抗疲勞［4］以及保護(hù)視網(wǎng)膜免受光損傷［5］等生理功效。國外對烏飯樹同屬植物研究和開發(fā)較早，目前已形成系列化產(chǎn)品如飲料、罐頭、果醬、果醋等［6－8］。中國國內(nèi)對烏飯樹同屬植物的研究較晚，相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)也不多，高附加值的產(chǎn)品較少。

植物多糖具有如抗腫瘤［9］、免疫調(diào)節(jié)［10］、抗凝血［11］和降血糖血脂［12］等多種生理功能。據(jù)Franz［13］報(bào)道植物多糖來源廣泛且沒有細(xì)胞毒性，目前已有近百種植物多糖被提取分離并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。本研究小組前期研究［14］發(fā)現(xiàn)烏飯樹樹葉多糖具有改善2型糖尿病小鼠血糖血脂的作用。本試驗(yàn)對烏飯樹樹葉多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨為烏飯樹資源尤其是烏飯樹樹葉多糖的開發(fā)利用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏飯樹樹葉：2011年購于江蘇溧陽；

其它常用試劑：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

分光光度計(jì)：725型，無錫市科達(dá)儀器有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ－3，上海滬西分析儀器廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－52，上海滬西分析儀器廠；

低速自動(dòng)平衡離心機(jī)：L550，湖南湘儀離心機(jī)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 VBTL多糖提取工藝流程

烏飯樹樹葉干燥粉碎過80目篩→浸提→離心取上清液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→乙醇沉淀→離心→沉淀復(fù)溶→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→VBTL多糖

1.2.2 浸提工藝優(yōu)化 以VBTL 多糖得率為指標(biāo)，分別考察料液比、提取時(shí)間、溫度、pH 對提取效果的影響?；緱l件：料液比1∶40（m∶V），時(shí)間2h，溫度60 ℃，pH 為8，改變其中一個(gè)條件，固定其它條件分別考察不同的影響因素。本試驗(yàn)各因素水平梯度：料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（m∶V）；提取時(shí)間1，2，3，4，5h；提取溫度30，40，50，60，70 ℃；pH 值8，9，10，11，12。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化VBTL多糖的提取工藝。

1.2.3 純化工藝優(yōu)化 以VBTL 多糖的純度為指標(biāo)，分別考察提取液與乙醇的體積比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇靜止時(shí)間對純度的影響。

1.2.4 多糖得率以及純度的計(jì)算 采用苯酚硫酸法［15］測總糖含量和直接滴定法測還原糖含量（GB／T 5009.7——2008）。分別按式（1）～（3）計(jì)算多糖的含量、得率及純度。

1.2.5 測總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為樣品，得到苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線為y ＝8.935 7x＋0.001，R2＝0.999 9。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 用Design－Expert 7.1.6分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸提工藝的單因素試驗(yàn)

2.1.1 料水比對多糖得率的影響 由圖1可知，VBTL 多糖得率隨料水比的增加而提高。當(dāng)料水比超過1∶40（m∶V）以后，VBTL多糖的得率隨著料水比增加上升趨勢漸近平緩，原因可能是在未達(dá)到擴(kuò)散平衡時(shí)，隨溶劑量的增加，多糖被提取出來的量就越多，當(dāng)擴(kuò)散達(dá)平衡時(shí)，溶劑量不再顯著影響多糖得率。這與張耀光等［17］在提取甘草多糖工藝中的研究結(jié)果相似。綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素，選擇料水比為1∶40（m∶V）。

2.1.2 提取時(shí)間對多糖得率的影響 由圖2可知，隨著提取時(shí)間的增加，VBTL多糖呈現(xiàn)以3h為頂峰的趨勢。這與鐘方麗等［18］在提取刺玫果糖工藝研究中的結(jié)果相似。當(dāng)提取3h時(shí)，得率達(dá)到最大值，說明此時(shí)糖在固液之間的傳質(zhì)基本達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡，因此，提取時(shí)間選擇為3h。

圖1 料水比對VBTL多糖得率的影響Figure 1 Effect of liquid－soild ratio on the yield of polysaccharides from VBTL

圖2 提取時(shí)間對VBTL多糖得率的影響Figure 2 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides from VBTL

圖3 溫度對VBTL多糖得率的影響Figure 3 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides from VBTL

2.1.3 溫度對多糖得率的影響 由圖3可知，在30～60 ℃時(shí)，VBTL多糖得率隨著溫度提高而提高；在60～70 ℃時(shí)，隨著提取溫度的提高，VBTL多糖得率反而有所下降。張彬等［19］研究開發(fā)的茶多糖提取工藝也得到了相似的結(jié)果，推測原因可能是溫度升高時(shí)，溶劑的滲透能力和溶解能力有所提高，加速了細(xì)胞內(nèi)多糖的浸出，但是過高的溫度可能改變糖的結(jié)構(gòu)，使其喪失活性。綜合考慮工藝可行性和多糖活性，選提取溫度為60 ℃。

2.1.4 pH 值對多糖得率的影響 由圖4可知，隨著pH 的升高，VBTL多糖得率呈現(xiàn)以pH 9為分界點(diǎn)的峰型變化趨勢。這與劉永錄等［20］研究的pH 對黃氏多糖收率影響的結(jié)果一致。推測原因［20］為堿能減弱細(xì)胞壁聚合物分子間的物理和化學(xué)作用，有利于多糖的浸出，提高其得率，但堿濃度過高，會使VBTL中的雜質(zhì)浸出，得率反而下降。因此溶液pH應(yīng)選擇9為宜。

圖4 溶液pH 對VBTL多糖得率的影響Figure 4 Effect of pH on the yield of polysaccharides from VBTL

2.2 VBTL多糖提取工藝Box－Behnken中心設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料水比、溫度、時(shí)間和pH 為因素，設(shè)計(jì)了一個(gè)四因素三水平中心組合設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1、表2。

表1 Box－Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及其編碼表Table 1 Box－Behnken design test factors and coding table

2.2.1 不同因素對VBTL多糖得率的影響 對表2進(jìn)行分析，得到如下回歸方程：

對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，誤差項(xiàng)不顯著，回歸模型顯著（α＜0.05），回歸模型的決定系數(shù)（R2）為0.869 7，表明回歸方程與實(shí)際情況吻合度高，認(rèn)為可以用該回歸方程來分析試驗(yàn)結(jié)果。從表3分析得到各因素的影響順序?yàn)樘崛囟龋玖纤龋緋H值＞提取時(shí)間。另外也可以看出各因素對響應(yīng)值的影響不是線性關(guān)系。

2.2.2 因素之間的交互作用影響 由表3可知，X1和X4為非常顯著項(xiàng)，將各項(xiàng)分析比較，結(jié)果見圖5～10。

由圖5～10可知，固液比和提取溫度之間的交互作用對VBTL多糖得率的影響較大。

表2 Box－Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box－Behnken design test results

2.2.3 尋取最優(yōu)值 根據(jù)軟件預(yù)測的Y 的最大估計(jì)值為69.4544mg／g，對應(yīng)條件為提取溫度65 ℃，提取時(shí)間2.5h，pH 值9.5，固液比1∶45（m∶V）。此條件下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為68.6291mg／g（n＝3），說明RSM 可用于優(yōu)化提取工藝條件，且結(jié)果與實(shí)際值接近。

2.3 VBTL多糖的純化工藝優(yōu)化

由于以上結(jié)果得出VBTL多糖的純度僅為38.27%，因此本試驗(yàn)對VBTL多糖的純化進(jìn)行了研究。選取提取液與乙醇的體積比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇靜止時(shí)間為因素設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)L9（34），對VBTL 多糖純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表3 方差分析表Table 3 ANOVA for the fitted quadratic polynomial model

圖5 提取時(shí)間與提取溫度交互作用Figure 5 Response surface of Interaction effect of extraction time and temperature

以VBTL多糖純度為考察指標(biāo)，由表5可知，各因素對VBTL多糖含量的影響順序?yàn)锽＞C＞A，且VBTL 多糖純化最佳工藝為A2B2C3，即：乙醇靜止時(shí)間為6h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%，提取液與乙醇體積比為1∶5。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平均VBTL多糖純度為52.03%（n＝3）。

圖6 溶液pH 與提取溫度交互作用Figure 6 Response surface of interaction effect of extraction pH and temperature

圖7 固液比與提取溫度交互作用Figure 7 Response surface of interaction effect of solid－liquid and extraction temperature

圖8 溶液pH 與提取時(shí)間交互作用Figure 8 Response surface of Interaction effect of extraction pH and time

3 結(jié)論

圖9 料水比與提取時(shí)間交互作用Figure 9 Response surface of interaction effect of solid－liquid and extraction time

圖10 固液比與溶液pH 交互作用Figure 10 Response surface of interaction effect of solid－liquid and extraction pH

表4 因素水平表Table 4 The table of factors and levels

本試驗(yàn)采用Box－Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化了VBTL 多糖的提取工藝，確定了最佳提取工藝：1∶45（m∶V）的料水比，調(diào)pH 到9.5，在65℃下提取2.5h，多糖得率為68.629 1mg／g，純度為38.27%，與預(yù)期模型所得數(shù)值接近，可以為烏飯樹樹葉多糖提取提供預(yù)測和理論基礎(chǔ)。同時(shí)采用正交試驗(yàn)L9（34）優(yōu)化得到多糖純化工藝：提取液與95%乙醇按1∶5（V∶V）混合，靜置6h，多糖純度提高到52.03%，試驗(yàn)結(jié)果可為VBTL 多糖的加工生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

但本試驗(yàn)所得VBTL多糖的純度不高，如需進(jìn)一步純化可采用凝膠色譜法和離子交換色譜等技術(shù)。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of orthogonal experiment

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