海蘆筍多糖超聲波輔助提取工藝及抗氧化活性研究

王 超 甄潤英

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系，天津 300384）

大量研究［1，2］表明，多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗?jié)?、抗衰老、降血脂等多種生理活性，因此多糖的提取具有廣泛的市場前景和應(yīng)用前景。多糖的提取方法很多，主要有常規(guī)水提法、酶法提取及溶劑提取法，常規(guī)的水浸提所需生產(chǎn)時間長、能耗高；酶法提取也存在成本高的問題［3］。植物細胞壁比較堅固，妨礙多糖的提取，一般在提取前要進行專門的破細胞操作［4］。超聲波處理是一種物理破碎的過程，超聲波是利用機械振動產(chǎn)生的能量，使媒質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生空間變化，促使有效成分快速進入溶劑中，同時，超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)又進一步破壞媒質(zhì)的細胞壁結(jié)構(gòu)，促使媒質(zhì)細胞內(nèi)的有效成分得以釋放，直接進入溶劑并充分混合，從而提高提取效果［5，6］。將超聲波技術(shù)用于天然植物活性成分的提取輔助手段，可以縮短提取時間，減少溶劑用量，提取率也有明顯的提高，凡此種種優(yōu)勢，使得超聲波技術(shù)近年來被廣泛應(yīng)用于很多提取工藝中［7，8］。

海蘆筍（Salicornia）又稱海篷子，又名石刁柏，為黎科莖肉質(zhì)化真鹽生植物，原產(chǎn)于美洲鹽沼地。目前，在中國遼寧、河北、山西、陜西、寧夏、甘肅、山東、江蘇等省區(qū)均有種植。海蘆筍是一種堿性作物，利用天然海水灌溉種植，不使用農(nóng)藥、化肥，是一種純天然新型有機蔬菜，具有獨特鮮美的風(fēng)味，享有“植物海鮮”的美譽［9，10］。另外，海蘆筍還是一種典型的堿性食品，含氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖和黃酮等活性物質(zhì)具有較高藥用和保健價值，可降低膽固醇，對提高人體免疫力及預(yù)防帕金森病具有明顯的作用，具有良好的減肥效果，對糖尿病、肥胖癥、癌癥、心血管等疾病也具有一定的預(yù)防作用［11，12］。因此，海蘆筍是一種開發(fā)前景十分廣闊的植物。由于中國引種海蘆筍時間不長，對海蘆筍的研究多集中于引種栽培，而對海蘆筍中活性成分的研究相對較少，尤其是海蘆筍多糖的研究鮮見報道。

本試驗以水為提取劑，對海蘆筍多糖超聲波輔助提取條件進行研究，同時采用體外抗氧化試驗確定海蘆筍多糖的抗氧化活性，為海蘆筍多糖功能食品、海蘆筍多糖類藥物的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海蘆筍：采集海蘆筍鮮葉（采自天津農(nóng)學(xué)院試驗田），自然干燥或于60℃左右烘箱中干燥至水分含量8%后粉碎，過40目篩，備用。

葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醇、H2O2溶液、FeSO4、水楊酸、抗壞血酸等：分析純，市售。

1.2 儀器設(shè)備

超聲－微波協(xié)同萃取儀：CW－2000型，上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－2000型，上海亞榮生化儀器廠；

可見分光光度計：WFJ7200型，尤尼柯（上海）儀器有限公司；

低速離心機：LD5－2B型，北京雷勃爾離心機有限公司；

冷凍干燥機：FD－1A－50型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝流程

海蘆筍→熱風(fēng)干燥后粉碎→超聲波處理→熱水浸提→4 000r／min離心10min→取上清液→濃縮至50%→1∶3（V∶V）醇沉→4 000r／min離心15min取沉淀→冷凍干燥→粗多糖成品

1.3.2 超聲波輔助提取條件的單因素試驗設(shè)計 分別考察超聲波處理時間、浸提時間、浸提溫度、料液比對多糖提取效果的影響。

（1）超聲波處理時間的影響：分別稱取5g海蘆筍干粉5份，按料液比為1∶20（m∶V）加入蒸餾水100mL，分別超聲波處理5，10，20，30，40，50min后，置于60 ℃下浸提2h，按方法1.3.1制得粗多糖，并測定多糖含量。

（2）浸提時間對多糖提取率的影響：分別稱取5g海蘆筍干粉5份，按料液比為1∶20（m∶V）加入蒸餾水100mL，超聲波處理10min，于60℃下，分別浸提時間1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，按方法1.3.1制得粗多糖，并測定多糖含量。

（3）浸提溫度對多糖提取率的影響：分別稱取5g海蘆筍干粉5 份，按料液比為1∶20（m∶V），超聲波處理10 min，分別于40，50，60，70，80 ℃下浸提2h，按方法1.3.1制得粗多糖，并測定多糖含量。

（4）料液比對多糖提取率的影響試驗：分別稱取5g海蘆筍干粉5 份，按料液比1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（m∶V），超聲波處理10min，浸提溫度為70℃，浸提時間為2h，按方法1.3.1制得粗多糖，并測定多糖含量。

1.3.3 超聲波輔助提取條件的優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以超聲波處理時間、浸提時間、浸提溫度、料液比為因素，設(shè)計了4因素3水平的正交試驗L9（34）。

1.3.4 海蘆筍多糖傳統(tǒng)水提工藝 稱取5g海蘆筍干粉，按料液比為1∶15（m∶V）加入蒸餾水，置于70℃下浸提1.5，2.0，2.5，3.0，3.5h，按方法1.3.1制得粗多糖，并測定多糖含量。

1.3.5 多糖含量的測定 采用苯酚－硫酸法測定多糖含量。多糖提取率按式（1）計算。

1.3.6 多糖抗氧化活性試驗方法 多糖體外抗氧化活性的測定采用改進的水楊酸法［13］，以抗壞血酸作為陽性對照。根據(jù)H2O2＋Fe →2＋·OH＋H2O＋Fe3＋，羥自由基氧化水楊酸得到2，3－二羥基苯甲酸，在510nm 處有最大吸收峰，吸光度與羥自由基（·OH）的量成正比。在反應(yīng)體系中加入羥自由基（·OH）清除劑后，被氧化的水楊酸減少，吸光度變小。

首先在反應(yīng)體系中加入9mmol／L 的FeSO4、9mmol／L的水楊酸－乙醇，以及不同濃度的供試樣品試液各1mL，最后加入8.8mmol／L H2O20.03mL，再啟動反應(yīng)。測得加入樣品試液后的吸光度；以1mL去離子水代替供試樣品試液，作為空白對照吸光度。每個濃度組平行測定3 次，取平均值，測定結(jié)果以清除率表示。清除率按式（2）計算。

利用Origin軟件計算提取物對羥自由基的半數(shù)抑制率（IC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理時間對多糖提取率的影響

超聲波處理時間對多糖提取率的影響見圖1。由圖1可知，在超聲波處理10 min時，海蘆筍多糖提取率較高，超過10min后提取率先下降后上升，在超聲波處理40 min時再次出現(xiàn)峰值，之后隨著處理時間的延長提取率降低?？赡苁怯捎诔暡ㄗ饔眠^程中，多糖先析出后被重新吸附導(dǎo)致多糖提取量出現(xiàn)波動，且超聲波處理時間延長，處理液溫度升高，可能會導(dǎo)致多糖的降解。因此，綜合考慮能源、提取效率及得率等問題，在正交試驗中采用5，10，15min的超聲波處理時間進行提取。

圖1 超聲波處理時間對海蘆筍多糖提取率的影響Figure 1 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction rate

2.2 浸提時間對多糖提取率的影響

浸提時間對多糖提取率的影響見圖2。由圖2可知，海蘆筍多糖提取率隨著浸提時間的增加呈先增加后減少的趨勢，提取時間2h時，多糖提取率最大。可能由于在試驗條件下浸提溫度較高，處理時間過長使得粗多糖中的糖蛋白組分緩慢變性析出，加之后期的高速離心使糖蛋白以不溶的沉淀狀物質(zhì)分離出來［14］；另外隨浸提時間的延長可能還會造成多糖的逐漸降解。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響Figure 2 Effect of extract time on the extraction rate

2.3 浸提溫度對多糖提取率的影響

浸提溫度對多糖提取率的影響見圖3。由圖3可知，隨著溫度的升高，海蘆筍多糖提取率逐漸提高。一般來說，提取溫度的提高，就會增加溶劑分子和溶質(zhì)分子的運動，促進擴散作用，從而有利于提高提取率，但是溫度過高有可能破壞有效成分，降低多糖活性，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的提出也將增加，會對后續(xù)處理帶來不便［15］。所以在試驗中應(yīng)在正確分析經(jīng)濟效益的基礎(chǔ)上，選用合理的浸提溫度。試驗中還發(fā)現(xiàn)，浸提溫度從70 ℃上升至80 ℃，多糖的提取率變化并不明顯，由4.35%上升到4.40%，因此，在正交試驗中，浸提溫度選擇50，60，70 ℃。

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響Figure 3 Effect of temperature on the extraction rate

2.4 料液比對多糖提取率的影響

料液比對多糖提取率的影響見圖4。由圖4可知，海蘆筍多糖提取率隨料液比的增加呈先增加后減少的趨勢，當料液比為1∶15（m∶V）時，多糖提取率最大。主要是由于液固兩相存在溶解平衡和吸附平衡，低溫有利于吸附，當料液比增大時，產(chǎn)生相同熱量的條件下，提取液的溫度下降，吸附作用增強導(dǎo)致提取率下降［16］。

圖4 料液比對多糖提取率的影響Figure 4 Effect of solid／liquid on the extraction rate

2.5 正交試驗結(jié)果及驗證實驗

2.5.1 正交試驗結(jié)果 正交試驗L9（34）試驗因素、水平及試驗結(jié)果見表1和表2。

表1 正交設(shè)計因子和水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal design

表2 正交試驗結(jié)果與分析Table 2 The results of the orthogonal test

由表2極差分析得出，影響海蘆筍多糖提取率的因素順序為浸提溫度＞料液比＞超聲波時間＞浸提時間，最優(yōu)提取工藝條件為C3D2A3B2，即：浸提溫度70 ℃，料液比1∶15（m∶V），超聲波處理15min，浸提時間2h。

2.5.2 驗證實驗 以最優(yōu)組合進行5次重復(fù)性實驗，多糖的提取率分別為6.20%，6.12%，6.13%，6.15%，6.00%，平均提取率為6.12%。

本試驗在正交試驗得到的最佳溫度（70 ℃）、最佳料液比（1∶15（m∶V））條件下，采用傳統(tǒng)浸提法提取2h，海蘆筍多糖的提取率僅為4.42%。由此可見，超聲波輔助提取可以用于海蘆筍多糖的工業(yè)化生產(chǎn)中。

2.6 多糖提取物對羥自由基的清除作用

不同濃度海蘆筍多糖提取物和抗壞血酸對羥自由基清除作用見圖5、圖6。

圖5 多糖提取物對羥自由基清除率的影響Figure 5 Effect of the extract on the on hydroxyl radical scavenging tracts

圖6 抗壞血酸對羥自由基清除率的影響Figure 6 Effect of the extract on the on ascorbic acid radical scavenging tracts

由圖5、圖6可知，海蘆筍多糖及抗壞血酸對羥自由基的清除作用均隨著其濃度的增加而逐漸增強，經(jīng)計算二者清除羥自由基的IC50分別為0.578，0.060mg／mL，海蘆筍多糖對羥自由基的清除能力大約是抗壞血酸的1／10。在相對較低的濃度下，海蘆筍多糖及抗壞血酸對羥自由基的清除作用隨著其濃度的增加而明顯增強，但當達到一定濃度后（海蘆筍多糖為2mg／mL、抗壞血酸為0.12 mg／mL）對羥自由基的清除效果趨于平緩。因此，如果作為天然抗氧化劑在實際生產(chǎn)中應(yīng)用時，要選擇適宜的劑量范圍，以達到最佳的抗氧化效果。

3 結(jié)論

以水為提取劑，通過超聲波輔助提取方法，篩選出海蘆筍多糖的最優(yōu)提取工藝，在此工藝下海蘆筍粗多糖提取率為6.12%，明顯高于傳統(tǒng)浸提法。海蘆筍多糖對羥自由基（·OH）具有明顯的清除作用，清除效果隨著多糖濃度增加而增強，由此可知，海蘆筍多糖具有一定的抗氧化性。由于試驗條件等因素的約束，對多糖的構(gòu)象未能給出結(jié)論，有待以后進一步研究。

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