鹽酸頭孢替安酯的聚合物檢查方法的建立與驗證

褚 良，張 哲

(遼寧省盤錦市食品藥品檢驗所，遼寧盤錦124010)

鹽酸頭孢替安酯(Cefotiam hexetil hydrochloride)為半合成第2代口服頭孢菌素類廣譜抗生素頭孢替安的酯化物，最早由日本武田藥業(yè)研制成功并上市。本品自身并無抗菌作用，口服后在腸道粘膜迅速水解為頭孢替安(CTM)被吸收而起效，因此其有效成分為頭孢替安。頭孢替安對革蘭陽性和陰性菌的抗菌活性與以往口服的頭孢菌素相同，而且對β－內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定。鹽酸頭孢替安酯可用于對本品敏感的葡萄球菌、肺炎球菌、嗜血流感桿菌所引起的咽喉炎、急性支氣管炎、慢性支氣管炎、肺炎、毛囊炎、淋巴節(jié)炎、乳腺炎、中耳炎等［1－3］。鹽酸頭孢替安酯不良反應(yīng)發(fā)生率約為3.6%，主要有腹瀉或軟便、嘔吐、腹痛、皮疹等。其屬于β－內(nèi)酰胺類抗生素，大量實驗和研究表明，β－內(nèi)酰胺類抗生素引起的速發(fā)型過敏反應(yīng)與其含有的聚合物有關(guān)(有些還與藥物的毒性反應(yīng)有關(guān)［4］)。所以控制產(chǎn)品中聚合物含量是減少此類抗生素過敏反應(yīng)的重要途徑之一［5］。目前β－內(nèi)酰胺類抗生素中聚合物的分析，主要是采用以葡聚糖凝膠G－10為天亮的凝膠色譜法［6－7］，但在日常實踐中也發(fā)現(xiàn)G－10凝膠色譜柱存在柱效低、分離效果差等缺點［8］。且G－10凝膠色譜柱只能用水系統(tǒng)作為流動性，不能加入任何有機(jī)溶劑，對于一些不易溶于水的酯類抗生素?zé)o法進(jìn)行分析。近年來高效分子排阻色譜(HPSEC)法逐漸成熟，并用于分析抗生素中的聚合物含量［9］，該方法更為準(zhǔn)確、靈敏、簡便易行，且其可以使用一定比例的有機(jī)溶劑作為流動性，因此應(yīng)用范圍更廣，是凝膠色譜發(fā)展的必然趨勢。本文參考了相關(guān)文獻(xiàn)，通過方法學(xué)驗證，建立了使用凝膠色譜柱(TSD G2500 PWxl)的HPSEC發(fā)分析鹽酸頭孢替安酯的聚合物，對此方法進(jìn)行了方法學(xué)驗證，并采用驗證后的方法對鹽酸頭孢替安酯進(jìn)行了檢驗，此方法檢驗鹽酸頭孢替安酯的聚合物可行。

1 儀器和試藥

1.1 儀器:島津2010A高效液相色譜儀

1.2 試藥:鹽酸頭孢替安酯對照品(廠家提供);供試品為某藥業(yè)提供的3批鹽酸頭孢替安酯(批號分別為:T111001，T111002，T111003);乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗:色譜柱為TSK G2500 PWxl凝膠柱(7.8 mm ×30 cm)(TOSOH Japan);流動相:pH7.0 的0.001 mol/L 磷酸鹽緩沖液［0.001 mol/L的磷酸氫二鈉溶液－0.001 mol/L的磷酸二氫鈉溶液(61∶39)］一乙睛(80∶20);流速0.5 mL/min;檢測波長為:254 nm;進(jìn)樣量為20 uL。取對照溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次峰面積的相對偏差應(yīng)小于2%。

2.2 對照品溶液的制備:取鹽酸頭孢替安酯對照品適量，精密稱定，用少量乙腈溶解后加流動相定量稀釋制成每1 mL中約含10 μg頭孢替安的溶液，作為對照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備:取鹽酸頭孢替安酯樣品適量，精密稱定，用少量乙腈溶解后加流動相定量稀釋制成每1 mL中約含1 mg頭孢替安的溶液，作為樣品溶液。

2.4 測定法:精密量取新配制的樣品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖;另精密量取對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。將鹽酸頭孢替安酯前的雜質(zhì)峰計為聚合物峰，按外標(biāo)法以峰面積計算，含鹽酸頭孢替安酯聚合物以頭孢替安計。

3 方法學(xué)考察

3.1 對照品線性關(guān)系:精密稱取鹽酸頭孢替安酯對照品30.13 mg，用乙腈溶解后分別加流動性稀釋制成含頭孢替安1.03 μg/mL、5.15 μg/mL、10.30 μg/mL、15.45 μg/mL、20.60 μg/mL的溶液，分別精密量取上述溶液各20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖。峰面積分別為:1297、6341、12382、19139、25842。以頭孢替安的濃度對峰面積作線性回歸，得回歸方程為:Y=1552.2X －158.01，r=0.9998。結(jié)果表明:進(jìn)樣濃度在1.03 μg/mL ～20.60 μg/mL 范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.2 對照品重復(fù)性

3.2.1 對照品溶液主峰的重復(fù)性:照“2.2”項下方法，取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，主峰面積分別為13765、13748、13692、13729、13801、13867.RSD=0.44%。重復(fù)性良好，可滿足檢驗要求。

3.2.2 對照品溶液F值測定重復(fù)性:精密稱取鹽酸頭孢替安酯對照品約30 mg，共6份，精密稱定，用少量乙腈溶解后加流動性定量稀釋制成每1 mL中含頭孢替安10 μg的溶液，分別精密量取6份對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。峰面積(A)與對照品稱樣量(W)的比值(校正因子F)有良好的重復(fù)性(見表1)，符合檢驗要求。

表1 對照品溶液校正因子日內(nèi)重復(fù)性

3.3 對照品溶液的穩(wěn)定性:照“2.2”項下方法，取對照品溶液，室溫放置 8 h，分別于 0、1、2、4、8 h 精密量取對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。主峰峰面積分別為13865、13816、13901、13787、13791，RSD=0.36%。對照品溶液室溫8 h內(nèi)穩(wěn)定，可滿足檢驗要求。

3.4 聚合物線性關(guān)系:分別精密稱取樣品適量(批號:T111001)置量瓶中，用少量乙腈溶解后加流動性分別稀釋制成每 1 mL 含頭孢替安 0.10 mg、0.52 mg、1.03 mg、1.55 mg、2.06 mg的溶液，分別精密量取上述溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。聚合物峰面積分別為:337、1798、3451、5103、6933。以頭孢替安的濃度對聚合物峰面積作線性回歸，得回歸方程為:Y=3334.6X+19.913，r=0.9998。結(jié)果表明:進(jìn)樣濃度在0.10 mg/mL～2.06 mg/mL范圍內(nèi)，濃度與聚合物峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.5 聚合物峰F值測定重復(fù)性:精密稱取鹽酸頭孢替安酯樣品(批號:T111001)約30 mg，共6份，精密稱定，用少量乙腈溶解后加流動性定量稀釋制成每1 mL中含頭孢替安1 mg的溶液，分別精密量取6份樣品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。聚合物峰面積(A)與樣品稱樣量(W)的比值(校正因子F)有良好的重復(fù)性(見表2)，符合檢驗要求。

表2 聚合物峰F值測定重復(fù)性

3.6 樣品溶液的穩(wěn)定性:照“2.3”項下方法，取樣品溶液，室溫放置 8 h，分別于 0、1、2、4、8 h 精密量取樣品溶液 20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。聚合物峰面積分別為3398、3584、3794、4077、5218，RSD=17.90%。樣品溶液室溫 8 h內(nèi)不穩(wěn)定，聚合物增加，因此樣品溶液應(yīng)臨用新制。

3.7 鹽酸頭孢替安酯定量限:以信噪比10∶1為指標(biāo)，測得顏色頭孢替安酯的定量限以頭孢替安計為0.66×10－5mg/mL。3.8 樣品聚合物的測定:照“2”項下方法測定3批樣品(批號分別為:T111001，T111002，T111003)聚合物的含量分別為0.21%，0.20%及 0.23%。

4 討論

4.1 色譜柱的選擇:建立上述測定方法時，同時考慮了Sephadex G－10和TSK G2500 PWxl兩種色譜柱。本品為酯類化合物，在水中溶解時形成膠狀體，不能完全溶解在水中，再向其中加入大量磷酸鹽緩沖液時形成絮狀的沉淀，但溶液中如果有一定比例的有機(jī)溶劑存在時就不會發(fā)生上述情況。由于Sephadex G－10色譜柱只能用水系統(tǒng)作為流動性，不能用有機(jī)溶劑，而上述形態(tài)的樣品進(jìn)到色譜柱中只能使色譜柱阻塞，無法進(jìn)行樣品分析，因此無法使用Sephadex G－10。而TSK G2500 PWxl色譜柱可用一定比例的有機(jī)溶劑，因此樣品可以很好的分散在溶劑中，可以進(jìn)行樣品分析。同時TSK G2500 PWxl柱分離的分子量范圍廣，柱效高，分析時間短，能在高效液相色譜儀上使樣品與聚合物實現(xiàn)良好的分離，分離度大于1.5，且峰形對稱，因此選擇了 TSK G2500 PWxl柱進(jìn)行本品聚合物的分離檢測。

4.2 流動性的離子強(qiáng)度、pH值及流速的選擇:流動性的離子強(qiáng)度、pH值及流速可以影響樣品中聚合物與主峰的分離度。同時考慮到樣品在緩沖鹽系統(tǒng)中的溶解性。最終選擇流動性的鹽濃度為 0.001 mol/L、pH 值為 7.0、流速為0.5 mL/min。

4.3 有機(jī)相比例的選擇:由于鹽酸頭孢替安酯的高分子雜質(zhì)分子量大小不一，且流動相中不含有機(jī)相時樣品溶解度不好。但加入一定量的有機(jī)相后可改善樣品溶解度同時聚合物共流出形成單個色譜峰。分別將流動相中0.005 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液和乙睛的比例設(shè)為70∶30、80∶20和90∶10進(jìn)行實驗，結(jié)果表明:當(dāng)流動相比例為90∶10時聚合物可見多個色譜峰，當(dāng)有機(jī)相比例增大為80∶20及70∶30時聚合物共流出形成單個色譜峰，頭孢替安酯與其聚合物實現(xiàn)有效分離。但由于有機(jī)相比例大時可能會縮短色譜柱的使用壽命，同時為了方便分析定量，因此選擇有機(jī)相比例為80∶20。

［1］ 劉玉魁.頭孢菌素類抗生素簡介［J］.中國鄉(xiāng)村醫(yī)藥，2006，13(2):40.

［2］ 徐鐵男.新口服頭孢菌素頭孢替安酯［J］.沈陽醫(yī)藥，1993，8(2):27－30.

［3］ 吳向文.頭孢菌素類藥物的作用特點不良反應(yīng)及合理應(yīng)用［J］.臨床用藥，2009，13(6):560 －562.

［4］ 胡昌勤.高效液相色譜法在抗生素質(zhì)控分析中的應(yīng)用［M］.下冊.北京:氣象出版社，2001:176 －204.

［5］ 張強(qiáng)，廖工鐵.頭孢類抗生素在水溶液中的聚合［J］.藥學(xué)學(xué)報，1996，31(4):306 －312.

［6］ 胡昌勤，金少鴻，孫學(xué)蘭.氨節(jié)青霉素中致敏性雜質(zhì)的比較分析及產(chǎn)品致敏性評價方法的建立［J］.中國抗生素雜志，1990，15(2):102.

［7］ 胡昌勤，金少鴻，孫學(xué)蘭.離子對凝膠色譜法分離頭抱菌素中高分子雜質(zhì)［J］.中國抗生素雜志，1990，15(5):357.

［8］ 胡昌勤，孫學(xué)蘭，金少鴻.離子對凝膠色譜分離頭孢菌素中高分子雜質(zhì)實驗條件的選擇［J］.中國抗生素雜志，1991，16(4):276.

［9］ 顧立素，胡昌勒，金少鴻.安美汀中高分子雜質(zhì)的分離分析與質(zhì)量控制［J］.藥物分析雜志，2001，2(1):13－15.