JNK通路促進(jìn)大鼠腦缺血再灌注海馬神經(jīng)元凋亡*

張 霞， 錢 濤， 高維娟， 劉莎莎

(1承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北承德067000;2河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北石家莊050026)

腦血管病是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)病、多發(fā)病，其致死率、致殘率均較高，缺血造成了腦組織的損傷，再灌注使可逆性缺血損傷加重，并通過(guò)各種反應(yīng)將可逆損傷轉(zhuǎn)化為不可逆損傷。有研究表明，在缺血再灌注損傷時(shí)存在一種細(xì)胞死亡形式即細(xì)胞凋亡，并在缺血/再灌注損傷的病理過(guò)程中起著重要作用。同時(shí)大量研究表明腦缺血再灌注可以激活c－Jun N端激酶(c－Jun N－terminal kinase，JNK)，而且JNK激活在腦缺血介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1－2］。因此本研究選擇特異性 JNK抑制劑SP600125和激動(dòng)劑茴香霉素(anisomycin)，觀察其對(duì)腦缺血再灌注后海馬神經(jīng)元caspase－3表達(dá)的影響，探討JNK通路在腦缺血再灌注誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡中的作用。

材料和方法

1 主要試劑

SP600125和anisomycin均購(gòu)自Enzo;二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma。SP600125及anisomycin用10%DMSO溶解配置成20 nmol/L及300 ng/L的貯存液避光于4℃冰箱保存。Caspase－3抗體(用于免疫組化)購(gòu)自Santa Cruz，DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉試劑公司?？筩aspase－3多克隆抗體(用于Western blotting)購(gòu)自Bioworld;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Solarbio;Trizol reagent購(gòu)自Invitrogen;隨機(jī)上、下游引物和TaqMan熒光探針由大連寶生物公司提供，Premix Ex TaqTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司;原位末端細(xì)胞凋亡POD檢測(cè)試劑盒購(gòu)自自Roche。其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 動(dòng)物及分組

成年SD雄性大鼠90只，清潔級(jí)，體重240～280 g，由天津山川紅實(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK(津)2009－001。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物處在同一環(huán)境(室溫22～25℃，避免強(qiáng)光及噪音刺激，足夠的食物和飲水)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、全腦缺血再灌注組、JNK抑制劑組+全腦缺血再灌注組、JNK激動(dòng)劑組+全腦缺血再灌注組、全腦缺血再灌注組+溶劑對(duì)照組。每組12只動(dòng)物。

3 模型制備

采用改良的四血管閉塞法制作大鼠全腦缺血模型。4%水合氯醛10 mL/kg腹腔麻醉，頸背側(cè)縱切口約1.5 cm，分離頸旁肌暴露第一頸椎橫突，尋找翼狀孔，用直徑0.5 mm的電凝針燒灼其中的椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞，縫合切口，然后分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并埋線備用，縫合切口。術(shù)后恢復(fù)24 h，選用恢復(fù)良好的動(dòng)物，用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈造成全腦缺血30 min，然后去除雙側(cè)微動(dòng)脈夾恢復(fù)血液灌流，以大鼠翻正反射消失、瞳孔散大作為全腦缺血成功的標(biāo)準(zhǔn)，且剔除癲癇發(fā)作大鼠。假手術(shù)組僅暴露雙側(cè)椎動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈，不凝閉椎動(dòng)脈，也不予微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈。其它組手術(shù)進(jìn)程同模型組，JNK抑制組、JNK激動(dòng)劑組以及溶劑對(duì)照組的動(dòng)物在夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈前30 min利用大鼠立體定位儀分別側(cè)腦室注射SP600125(SP600125溶于10%DMSO，最終濃度為 20 mmol/L)、anisomycin(anisomycin溶于10%DMSO，最終濃度為300 μg/L)或10%DMSO，各10 μL。藥物在5 min內(nèi)注完，留針2 min。

4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)海馬組織caspase－3的表達(dá)

取海馬冠狀石蠟切片，采用SP法行免疫組組化學(xué)染色。切片依次脫蠟至水，PBS浸泡5 mim，電磁爐水浴抗原修復(fù)，修復(fù)完后，自然冷卻至室溫;3% H2O2孵育30 min，PBS沖洗5 min，3次，滴加正常山羊封閉血清，室溫孵育30 min，傾去勿洗;滴加1∶100的caspase－3多抗，4℃冰箱過(guò)夜;次日37℃溫箱孵育30 min，PBS沖洗5 min，3次，擦干切片周圍水分后，滴加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，37℃溫箱孵育30 min; PBS沖洗5 min，3次，擦干切片周圍水分后，滴加SP復(fù)合物即鏈酶親和素－生物素－過(guò)氧化物酶復(fù)合物，37℃溫箱孵育30 min;三蒸水洗5 min，3次，DAB顯色，脫水、透明、封片。每張切片在大腦海馬CA1區(qū)隨機(jī)選擇5個(gè)400倍視野，通過(guò)MiVnt圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。

5 Western blotting檢測(cè)海馬組織caspase－3蛋白水平

稱取海馬組織，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量，應(yīng)用Western blotting方法對(duì)各組大鼠海馬組織的caspase－3蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)。取25 μg樣品，以12%SDS－PAGE電泳分離，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，0.5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，抗體孵育(caspase－3Ⅰ抗?jié)舛?∶500孵育2 h)，TBST洗膜3次，然后用兔抗大鼠的Ⅱ抗(濃度1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜后采用ECL發(fā)光液顯色，X射線底片曝光。以β－actin為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)海馬組織caspase－3 mRNA表達(dá)

取－80℃保存的海馬組織，Trizol法抽提總RNA，RNA定量后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成的cDNA為模板，構(gòu)建質(zhì)粒，制備合適的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行10倍倍比稀釋，以103、104、105、106和107拷貝作陽(yáng)性模板，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)2個(gè)重復(fù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)應(yīng)用ABI的Primer Express 3.0設(shè)計(jì)的引物及帶有5'FAM熒光基團(tuán)和3'Eclipse淬滅基團(tuán)的TaqMan水解探針，采用Premix Ex TaqTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒一步法檢測(cè)各組海馬組織中caspase－3 mRNA表達(dá)。25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下:先95℃60 s，再95℃10 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)點(diǎn)選在60℃反應(yīng)后單點(diǎn)接收熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后獲取循環(huán)閾值(Ct值)，對(duì)拷貝數(shù)以10為底取對(duì)數(shù)，作為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

7 TUNEL染色法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平

取相應(yīng)的組織玻片常規(guī)脫蠟脫水，經(jīng)蒸餾水浸泡及PBS洗滌后滴加H2O2，37℃烤箱放置40 min后PBS洗滌，滴加蛋白酶K后37℃孵育10 min，PBS洗滌。將凋亡檢測(cè)試劑盒中試劑1與試劑2配成TUNEL反應(yīng)混合物，混勻后加在經(jīng)上述處理的切片上，37℃烤箱放置60 min后PBS洗滌，滴加轉(zhuǎn)化劑POD，37℃烤箱放置30 min后洗滌，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。400倍顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取不重疊的5個(gè)CA1區(qū)視野，計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取均值為該例計(jì)數(shù)結(jié)果。定量分析方法為光鏡下計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1 JNK抑制劑與激動(dòng)劑對(duì)海馬組織caspase－3蛋白表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)染色顯示，caspase－3陽(yáng)性表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。模型組caspase－3表達(dá)量最高，與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組相比，JNK抑制劑組caspase－3表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，而JNK激動(dòng)劑組caspase－3表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，溶劑對(duì)照組則無(wú)明顯差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Effects of JNK inhibitor(SP600125)and agonist(anisomycin)on expression of caspase－3 protein in rat hippocampal tissues after cerebral ischemia－reperfusion(IR)(immunohistochemical staining，×400).±s.n=6.#P＜0.05 vs sham; *P＜0.05 vs cerebral IR.圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)JNK抑制劑和激動(dòng)劑對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬組織caspase－3蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，海馬組織caspase－3蛋白同免疫組化表達(dá)變化一致，見(jiàn)圖2。

2 JNK抑制劑與激動(dòng)劑對(duì)海馬組織caspase－3 mRNA的影響

對(duì)本實(shí)驗(yàn)中所提取的RNA進(jìn)行紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，結(jié)果為1.8 ＜A260/A280＜2.0。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，拷貝的范圍在103～107內(nèi)，Ct值和cDNA拷貝數(shù)呈線性關(guān)系，線性關(guān)系較好，說(shuō)明定量準(zhǔn)確、可靠，見(jiàn)圖3。Caspase－3 mRNA同caspase－3蛋白表達(dá)變化一致，見(jiàn)圖4。

3 JNK抑制劑與激動(dòng)劑對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果顯示，各組海馬神經(jīng)元凋亡情況同免疫組化表達(dá)變化一致，見(jiàn)圖5。

討論

Figure 2.Effects of JNK inhibitor(SP600125)and agonist(anisomycin)on expression of caspase－3 protein in rat hippocampal tissues after cerebral ischemia－reperfusion(IR)detected by Western blotting.±s.n=6.#P＜0.05 vs sham;*P＜0.05 vs cerebral IR.圖2 Western blotting檢測(cè)JNK抑制劑和激動(dòng)劑對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬組織caspase－3蛋白表達(dá)的影響

Figure 3.PCR standard curve for caspase－3 quantification圖3 Caspase－3的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure 4.Effects of JNK inhibitor(SP600125)and agonist (anisomycin)on expression of caspase－3 mRNA in rat hippocampal tissues after cerebral ischemiareperfusion(IR)detected by real－time PCR.±s.n=6.#P＜0.05 vs sham;*P＜0.05 vs cerebral IR.圖4 JNK抑制劑和激動(dòng)劑對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬組織caspase－3 mRNA表達(dá)的影響

Figure 5.Effects of JNK inhibitor(SP600125)and agonist(anisomycin)on apoptosis of rat hippocampal neurons after cerebral ischemia－reperfusion(IR)(TUNEL staining，×400).±s.n=6.#P＜0.05 vs sham;*P＜0.05 vs cerebral IR.圖5 JNK抑制劑和激動(dòng)劑對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

缺血再灌注損傷最早是于1960年由Jenings首先提出，目前學(xué)者一致認(rèn)為:缺血再灌注損傷是由多種因素、多種機(jī)制交互式作用、相互影響而導(dǎo)致的極其復(fù)雜的病理生理過(guò)程。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷與絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)［3－4］。絲裂原活化蛋白激酶是細(xì)胞內(nèi)的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，它受到刺激后磷酸化而活化。而JNK/SAPK是哺乳類細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶中極為重要一個(gè)亞類，逐漸引起普遍的關(guān)注。JNK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與腦組織缺血再灌注損傷有密切聯(lián)系［5］。已有研究表明JNK信號(hào)通路可被缺血再灌注的應(yīng)激刺激激活［6－7］，而且JNK激活與神經(jīng)元凋亡有關(guān)。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，JNK在局灶和全腦缺血神經(jīng)元凋亡過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［8］，腦缺血再灌注的刺激首先激活JNK信號(hào)通路模塊中的MAPKKK;繼而激活MAPKK，包括MKK4和MKK7，最后激活JNKs［9］。激活的JNK又可進(jìn)一步磷酸化其核底物及胞漿底物，促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡。JNK激活后可通過(guò)2條途徑發(fā)揮作用:一是上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)從而激活死亡受體凋亡通路，另一條途徑是通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl－2家族成員的活性參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，2條途徑最終都可激活caspase－3。通過(guò)這2條途徑激活的caspase－3可激活CAD (caspase－activated DNase)，并可切割核DNA修復(fù)酶PARP［poly(ADP－ribose)polymerase］，從而導(dǎo)致核DNA不可復(fù)性的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase－3是半胱氨酸蛋白酶家族中的重要成員，并且在細(xì)胞凋亡過(guò)程中處于核心地位，凋亡的最后實(shí)施是通過(guò)它的激活而實(shí)現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用 JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑SP600125和激動(dòng)劑anisomycin對(duì)全腦缺血再灌注后海馬神經(jīng)元損傷進(jìn)行干預(yù)，并觀察其對(duì)caspase－3蛋白和mRNA的影響，以及海馬神經(jīng)元凋亡的情況，來(lái)探究JNK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦缺血再灌注損傷中的機(jī)制，從而為臨床上出現(xiàn)的腦缺血再灌注損傷提供新的治療措施。SP600125是一種非常有效的選擇性抑制JNK－1、2、3的抑制劑，通過(guò)可逆性競(jìng)爭(zhēng)ATP抑制JNK的磷酸化，達(dá)到抑制JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，而anisomycin能通過(guò)活化JNK，進(jìn)一步通過(guò)死亡受體通路和線粒體通路，起到促進(jìn)腦缺血再灌注誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的作用。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用SP600125對(duì)腦缺血再灌注干預(yù)后，由于此細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被阻斷，海馬組織的caspase－3蛋白和mRNA較缺血再灌注組明顯下降，凋亡細(xì)胞也明顯下降;而應(yīng)用anisomycin對(duì)腦缺血再灌注干預(yù)后，由于此細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，海馬組織的caspase－3蛋白和mRNA較缺血再灌注組明顯增加，同時(shí)凋亡細(xì)胞也明顯增加;同時(shí)溶劑對(duì)照組與缺血再灌注組相比則無(wú)明顯變化。由此推測(cè)缺血再灌注損傷與JNK激活密切相關(guān)。

總之，JNK通路參與了腦缺血再灌注后的海馬神經(jīng)元凋亡，最終通過(guò)促進(jìn)caspase－3的表達(dá)來(lái)發(fā)揮促凋亡作用。

［1］ Chang L，Karin M.Manmalian MAP kinase signalling cascades［J］.Nature，2001，10(6824):37－40.

［2］ 王耀岐，李 軍，曹 紅，等.ERK和JNK通路在沙土鼠腦缺血預(yù)處理中的表達(dá)及作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(3):337－340.

［3］ King LA，Toledo AH，Rivera－Chavez FA，et al.Role of p38 and JNK in liver ischemia and reperfusion［J］.Hepatobiliary Pancreat Surg，2009，16(6):763－770.

［4］ Li L，Zhang YM，Qiao WL，et al.Role of mitogen－activated protein kinases in the regulation of paraventricular nucleus to gastric ischemia－reperfusion injuries［J］.Chin Med J(Engl)，2007，120(12):1082－1087.

［5］ 王 寧，薛榮亮，姚鳳珍，等.SP600125－JNK抑制劑對(duì)大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)元的保護(hù)作用［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(20):1838－1841.

［6］ Gu Z，Jiang Q，Zhang G.c－Jun N－terminal kinase activation in hippocampal CA1 region was involved in ischemic injury［J］.Neuroreport，2001，12(5):897－900.

［7］ Tian H，Zhang G，Li H，et al.Antioxidant NAC and AMPA/KA receptor antagonist DNQX inhibited JNK3 activation following global ischemia in rat hippocampus［J］.Neurosci Res，2003，46(2):191－197.

［8］ Irving EA，Bamford M.Role of mitogen－and stress－activated kinases in ischemic injury［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22(6):631－647.

［9］ Brunet A，Pouysségur J.Mammalian MAP kinase modules: how to transduce specific signals［J］.Essays Biochem，1997，32:1－16.