反義miR－196a對(duì)人胰腺癌PANC－1細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用*

張世能， 莊曉虹， 唐 健， 莊燕妍， 黃鳳婷， 陳文博， 程文捷

(1中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510120;2海南省農(nóng)墾總醫(yī)院腫瘤血液科，海南海口571103)

微小RNA(microRNA)是一類(lèi)真核生物內(nèi)源性小分子單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度通常為18～25個(gè)核苷酸，microRNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制抑制靶基因表達(dá)而發(fā)揮“癌基因”或“抑癌基因”作用［1］。胰腺癌早期診斷困難，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后惡劣。既往胰腺癌的分子機(jī)制研究多關(guān)注于編碼基因的作用，隨著非編碼RNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)性研究的不斷深入，業(yè)已顯示胰腺癌存在特異的microRNA表達(dá)譜，研究表明血清miR－196水平與胰腺癌預(yù)后相關(guān)［2］。采用化學(xué)合成的反義microRNA，可以特異地靶向敲除單個(gè)的microRNA分子，從而達(dá)到下調(diào)某microRNA活性的目的［3］。本研究中，我們首先檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞系miR－196a的表達(dá)狀況，在此基礎(chǔ)上，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的反義miR－196a，觀(guān)察反義miR－196a對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC－1體外增殖、侵襲和遷移能力的影響作用及其機(jī)制，以期探討胰腺癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制和防治的新靶點(diǎn)。

材料和方法

1 細(xì)胞及主要試劑

人胰腺癌細(xì)胞系CAPAN－2、BXPC－3、SW1990和PANC－1由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化實(shí)驗(yàn)室保存，體外培養(yǎng)傳代。永生化人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系H6c7由加拿大安大略癌癥研究所Prof.Mingsound Tsao惠贈(zèng)，體外培養(yǎng)傳代。miR－196a(貨號(hào): 4373104)及其引物 RNU6B(貨號(hào):4363381)購(gòu)自ABI。反義miR－196a和miR－negative control(NC)購(gòu)自上海吉瑪公司。LipofectamineTM2000(Lipo)、Opti－MEM培養(yǎng)基、K－SFM培養(yǎng)基、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase Kit)和PCR試劑購(gòu)自Invitrogen。DMEM液體培養(yǎng)基、重組表皮生長(zhǎng)因子 (recombinant epidermal growth factor，rEGF)、牛垂體提取物(bovine pituitary extract，BPE)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購(gòu)自Gibco。Transwell板購(gòu)自Corning。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2～3 d換液或傳代1次，以0.02% EDTA和0.25%胰蛋白酶的1∶1混合液消化，完全培養(yǎng)基中和。H6c7細(xì)胞培養(yǎng)于K－SFM培養(yǎng)基(含1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、0.2 μg/L rEGF和20 mg/L BPE)在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，采用0.05%胰蛋白酶消化，以0.4%BSA 1∶1中和。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 反義miR－196a組:使用Lipo將反義miR－196a轉(zhuǎn)染入PANC－1細(xì)胞(終濃度100 nmol/L);miR－NC組:使用Lipo將miR－NC(終濃度100 nmol/L)轉(zhuǎn)染入PANC－1細(xì)胞;Lipo組:僅轉(zhuǎn)染Lipo的PANC－1細(xì)胞;空白組:常規(guī)培養(yǎng)的PANC－1細(xì)胞，不加Lipo和microRNA片段。各組在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h，觀(guān)察細(xì)胞增殖情況，轉(zhuǎn)染后48 h檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞遷移能力。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR－196a表達(dá) 分別收集各組細(xì)胞，采用 Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，異丙醇法濃縮RNA，瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA的完整性。取2 μg總RNA，用SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase Kit逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，應(yīng)用LightCycler 480型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche)進(jìn)行PCR定量檢測(cè)。PCR條件:95℃15 s，60℃30 s，74℃ 30 min，40個(gè)循環(huán)。記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)域值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值;以U6作為內(nèi)參照，采用定量PCR中的相對(duì)定量法，各組細(xì)胞中miR－196a相對(duì)表達(dá)率采用2－ΔΔCt法計(jì)算。

2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒－8(cell counting kit－8，CCK－8)檢測(cè)細(xì)胞增殖 具體方法參照CCK－8試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將PANC－1細(xì)胞按1×104cells/well接種于96孔培養(yǎng)板(100 μL/well)中，適時(shí)轉(zhuǎn)染，分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h，每孔加入10 μL CCK－8試劑，5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，終止孵育，上機(jī)檢測(cè)(以培養(yǎng)基+10 μL CCK－8作為空白調(diào)零孔)。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔450 nm和630 nm雙波長(zhǎng)處吸光度(A)。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組轉(zhuǎn)染后48 h，制備單細(xì)胞懸液，4℃ 1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌、離心、重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/ L。按照Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)試劑盒說(shuō)明書(shū)染色后使用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果以凋亡細(xì)胞百分率(%)表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 取出Matrigel，在冰上融化，按1∶8稀釋(用不完全DMEM)，取50 μL在Transwell上室制備人工基底膜，置37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱4 h后備用。各組細(xì)胞用無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)基洗2次后，調(diào)整細(xì)胞密度為109/L，各取100 μL接種到Transwell小室內(nèi)，每組重復(fù)3孔;同時(shí)在24孔板內(nèi)(下室)加入500 μL含20% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)8 h后取出小室，用棉簽擦去上層細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗2次，0.1%結(jié)晶紫染色15 min;洗滌殘余染料，倒置顯微鏡觀(guān)察并拍照，每組隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 除不用Matrigel在Transwell上室制備人工基底膜外，余下方法同前侵襲實(shí)驗(yàn)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 螢光素酶報(bào)告基因的檢測(cè) microRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件(PicTar、TargetScan和miRanda)提示核因子κB抑制蛋白α(nuclear factor κB inhibitor α，NFKBIA)mRNA 3'UTR的390～396位點(diǎn)是miR－196a的可能結(jié)合位點(diǎn)(binding site，BS)。體外合成該位點(diǎn)的DNA片段并將該序列插入到psi－CHECKTM－2載體(Promega)海腎螢光素酶編碼基因的下游，構(gòu)建成野生型NFKBIA的3'UTR螢光素酶表達(dá)載體。根據(jù)microRNA與靶基因結(jié)合的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物對(duì)miR－196a與NFKBIA的3'UTR相結(jié)合的種子序列區(qū)進(jìn)行突變，構(gòu)建成突變型NFKBIA的3'UTR螢光素酶表達(dá)載體。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液涂布于含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB培養(yǎng)皿過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落經(jīng)99℃、5 min熱裂解，取上清做PCR鑒定陽(yáng)性克隆，并以質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行Xho I和Not I雙酶切和測(cè)序鑒定，酶切產(chǎn)物以含溴化乙啶的1%瓊脂糖凝膠電泳分離，UVP凝膠成像系統(tǒng)成像。載體鑒定成功后，將野生型/突變型NFKBIA的3'UTR螢光素酶表達(dá)載體與反義 miR－196a/對(duì)照 microRNA共轉(zhuǎn)染PANC－1細(xì)胞，每組重復(fù)3復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后48 h，使用雙螢光素酶檢測(cè)試劑盒(E1910，Promega)檢測(cè)海腎螢光素酶的活性，同時(shí)檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性作為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1 miR－196a在胰腺癌細(xì)胞系及H6c7中的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)以永生化正常胰腺導(dǎo)管上皮H6c7細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞系CAPAN－2、BXPC－3、SW1990和PANC－1中miR－196a的表達(dá)，結(jié)果顯示:與H6c7細(xì)胞相比，人胰腺癌細(xì)胞系中miR－196a的表達(dá)水平明顯上調(diào)，見(jiàn)圖1。本課題選擇PANC－1為進(jìn)一步的研究對(duì)象。

Figure 1.Overexpression of miR－196a in pancreatic cancer cells.±s.n=3.*P＜0.05 vs H6c7.圖1 胰腺癌細(xì)胞miR－196a的過(guò)表達(dá)

2 轉(zhuǎn)染反義miR－196a后PANC－1細(xì)胞中miR－196a的表達(dá)變化

如圖2所示，定時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，若以miR－NC組細(xì)胞的miR－196a表達(dá)量作為1，反義miR－196a轉(zhuǎn)染組PANC－1細(xì)胞miR－196a表達(dá)量約為0.2，明顯下調(diào)近80%(P＜0.01)。而其它3組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Figure 2.Anti－miR－196a down－regulated the expression of miR－196a in PANC－1 cells.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs other groups.圖2 反義miR－196a的轉(zhuǎn)染下調(diào)PANC－1細(xì)胞miR－196a的表達(dá)

3 轉(zhuǎn)染反義miR－196a對(duì)PANC－1細(xì)胞增殖和凋亡的影響

CCK－8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的PANC－1細(xì)胞的各組間的細(xì)胞增殖能力，對(duì)各組所測(cè)得的A值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)各組間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示:反義miR－196a轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為15.45%± 7.99%，miR－NC組為15.57% ±5.45%，Lipo組為14.47%±6.47%，空白組為9.79% ±4.40%，見(jiàn)圖3。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示各組細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異(P＞0.05)。這些結(jié)果表明反義 miR－196a轉(zhuǎn)染對(duì)PANC－1細(xì)胞體外增殖和凋亡無(wú)顯著影響。

Figure 3.Inhibitory effect of miR－196a down－regulation on the apoptosis of PANC－1 cells 48 h after transfection detected by flow cytometry.A:blank control group;B:Lipo group;C:miR－NC group;D:anti－miR－196a group.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染反義miR－196a對(duì)PANC－1細(xì)胞凋亡的影響

4 轉(zhuǎn)染反義miR－196a對(duì)PANC－1細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

在200倍光鏡下觀(guān)察可見(jiàn)空白組細(xì)胞有一定的侵襲和遷移能力，48 h每個(gè)視野下侵襲(遷移)數(shù)為106.3±11.2(61.0±5.0)，Lipo組為97.1±13.8 (56.0±7.0)，miR－NC組為98.2±12.9(58.2± 5.6)，反義 miR－196a組為 56.3±7.1(32.3± 4.6)。與其它3組比較，反義miR－196a組細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯受抑(P＜0.01)，而其它3組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖4。

5 雙螢光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)

生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)NFKBIA可能是 miR－196a的靶基因之一，見(jiàn)圖5。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果構(gòu)建雙螢光素酶報(bào)告基因載體導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。培養(yǎng)后挑取單克隆菌落進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序顯示構(gòu)建成功，見(jiàn)圖6。將構(gòu)建成功的雙螢光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染入PANC－1細(xì)胞48 h后，分別檢測(cè)海腎螢光素酶和螢火蟲(chóng)螢光素酶活性，并使用內(nèi)參螢火蟲(chóng)螢光素酶對(duì)海腎螢光素酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。結(jié)果顯示:共轉(zhuǎn)染野生型NFKBIA的3'UTR和反義miR－196a可使海腎螢光素酶相對(duì)活性較共轉(zhuǎn)染野生型NFKBIA的3'UTR和對(duì)照microRNA者顯著降低(P＜0.05)，而共轉(zhuǎn)染突變型NFKBIA的3'UTR和miR－196a則較之無(wú)明顯差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖7。

討論

研究表明胰腺癌存在獨(dú)特的microRNA表達(dá)譜。zhang等［4］報(bào)道了8個(gè)microRNA在所研究的標(biāo)本中表達(dá)的陽(yáng)性率達(dá)到70%～100%，表達(dá)上調(diào)差異性在3～2 018倍。它們是miR－196a、miR－190、miR－186、miR－221、miR－222、miR－200b、miR－15b和 miR－95。本課題組前期采用博奧公司和康成公司的芯片分別檢測(cè)了胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞中的microRNA表達(dá)譜，顯示miR－196a是一個(gè)在胰腺癌中表達(dá)異常增高的microRNA［5］。

Figure 4.Inhibitory effect of miR－196a down－regulation on PANC－1 cell invasion(×200).A:blank control group;B:Lipo group;C:miR－NC group;D:anti－miR－196a group.圖4 體外Transwell遷移實(shí)驗(yàn)觀(guān)察下調(diào)miR－196a后對(duì)PANC－1細(xì)胞侵襲能力的抑制作用

Figure 5.Identification of NFKBIA as an miR－196a target by TargetScan program.圖5 生物信息學(xué)分析NFKBIA是miR－196a的靶基因之一

miR－196a與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能有關(guān)。Dou等［6］通過(guò)SNP分析顯示miR－196a多態(tài)性與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯相關(guān)。Peng等［7］的研究發(fā)現(xiàn)miR－196a－2突變的純合子CC與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn) miR－196a與白血?。?］、食管癌［9］、結(jié)腸癌［10］等腫瘤的分化、增殖、凋亡和遷移相關(guān)。雖然miR－196a在胰腺癌中呈高表達(dá)，且有研究表明miR－196a－2表達(dá)與胰腺癌預(yù)后相關(guān)，但是miR－196a在胰腺癌中的作用遠(yuǎn)沒(méi)有被闡明。本研究通過(guò)直接瞬時(shí)轉(zhuǎn)染microRNA對(duì)miR－196a功能進(jìn)行了檢測(cè)，該法優(yōu)點(diǎn)在于化學(xué)合成反義microRNA簡(jiǎn)便、快捷，可避免構(gòu)建表達(dá)載體的步驟，從而有效提高特定microRNA的表達(dá)。本研究將反義miR－196a轉(zhuǎn)染入PANC－1細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)miR－196a表達(dá)下調(diào)，結(jié)果顯示反義miR－196a轉(zhuǎn)染后對(duì)PANC－1細(xì)胞增殖和凋亡無(wú)明顯影響，但對(duì)細(xì)胞體外遷移能力具有明顯抑制作用。

為了解miR－196a影響細(xì)胞侵襲遷移能力的可能機(jī)制，我們構(gòu)建含野生型或突變型NFKBIA的3' UTR螢光素酶表達(dá)載體，結(jié)果顯示:共轉(zhuǎn)染野生型NFKBIA的3'UTR和反義miR－196a可使海腎螢光素酶相對(duì)活性較共轉(zhuǎn)染野生型NFKBIA的3'UTR和對(duì)照microRNA者顯著降低，而共轉(zhuǎn)染突變型NFKBIA的3'UTR和miR－196a則較之無(wú)明顯差異。NFKBIA是IκB家族的重要成員之一，在靜息狀態(tài)下，存在于細(xì)胞胞漿中，與NF－κB的二聚體組成三聚體滯留于胞質(zhì)中而處于無(wú)活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到外源性刺激時(shí)，IκB迅速降解，NF－κB被激活且從三聚體中釋放出來(lái)，借助于核定位信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。NFKBIA在多種腫瘤如前列腺癌、結(jié)直腸癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中呈低表達(dá)。最近Bredel等［11］研究表明在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中NFKBIA常缺失，但不突變;NFKBIA缺失對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)病的影響類(lèi)似于EGFR擴(kuò)增，和生存期相對(duì)較短相關(guān)。本研究初步顯示miR－196a可能參與胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的調(diào)控，反義miR－196a可提高NFKBIA的表達(dá)，間接阻止NF－κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而抑制其下游基因的表達(dá)，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，我們將進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和NF－κB信號(hào)通路相關(guān)基因的檢測(cè)以證實(shí)上述假設(shè)。

Figure 6.The electrophoresis of NFKBIA vector and double digestion for identification.M1:DL2000 DNA marker; Lane 1:original plasmid;Lane 2:plasmid with double digestion;M2:1 kb DNA marker;yellow arrow: NFKBIA;red arrow:psi－CHECKTM－2 vector.圖6 NFKBIA雙螢光素酶報(bào)告基因雙酶切鑒定電泳圖

Figure 7.The cotransfection of wild－type NFKBIA 3＇－UTR and anti－miR－196a significantly down－regulated the relative activity of Renilla luciferase(Rluc)normalized to firefly luciferase(Fluc)compared with other groups，while there was no significant difference when cotransfected with mutant－type NFKBIA 3＇－UTR and anti－miR－196a.±s.n=3.*P＜0.05 vs other groups.圖7 雙螢光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)

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