野豌豆屬4個(gè)品種(系)的染色體核型

管 超，張吉宇，王彥榮，聶 斌

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

春箭筈豌豆(Viciasativa)是豆科(Leguminosae)野豌豆屬(Vicia)一年生或越年生草本植物。普遍種植于我國長江中下游、華北和西北諸省區(qū)[1]。耐干旱、耐貧瘠，不耐鹽堿和水漬，喜冷涼氣候，宜早春和晚秋生長，與其他作物間種或套種時(shí)有一定的耐陰性。莖枝柔嫩、葉量多，適口性好、營養(yǎng)價(jià)值高，是優(yōu)良的綠肥、飼草和糧食兼用作物[2]。

自1998 年以來，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院以早熟、高產(chǎn)為指標(biāo)，開展了春箭筈豌豆品種選育[3]，至今已成功培育出品種“蘭箭3號”、品系2556和2560。這3個(gè)品種(系)的農(nóng)藝學(xué)性狀均具有一定的差異[4]，存在基因型與環(huán)境穩(wěn)定互作[5]。目前國內(nèi)外學(xué)者已在狹葉野豌豆(V.angustifolia)[6-7]、廣布野豌豆(V.cracca)[8]、山野豌豆(V.amoena)[9]及褐毛野豌豆(V.pannonica)[10]等多種野豌豆屬植物中開展過染色體核型研究，但在春箭筈豌豆中的研究僅見于兩個(gè)亞種V.sativasubsp.sativa和V.sativasubsp.nigra[11]。已有關(guān)于春箭筈豌豆種子顏色遺傳[12]和細(xì)胞遺傳學(xué)[13]的相關(guān)研究，但關(guān)于春箭筈豌豆不同品種(系)間染色體遺傳多樣性的研究鮮見報(bào)道。鑒于此，本研究對不同品種(系)的春箭筈豌豆進(jìn)行染色體核型分析，深入探究不同品種(系)春箭筈豌豆的染色體核型特征和染色體遺傳多樣性，以期為利用染色體資料指導(dǎo)植物同源染色體加倍、種屬間雜交、人工異源多倍體合成等技術(shù)改良或培育植物新品種提供細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料及來源 供試材料包括蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院選育的春箭筈豌豆品種“蘭箭3號”，品系2556、2560，甘肅省廣為種植的狹葉野豌豆品種333/A作為對照。春箭筈豌豆品種(系)種子為蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生產(chǎn)，333/A由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所提供。

1.2方法 將成熟的野豌豆屬種子放入培養(yǎng)皿中，加適量的水置于25 °C培養(yǎng)箱內(nèi)生根，待幼根長約1 cm時(shí)于09：00-10：00取材；采用低溫預(yù)處理的方法[14]，在4 °C條件下處理24 h；預(yù)處理后的幼根于卡諾液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1)中固定20～24 h；固定后的幼根用去離子水反復(fù)沖洗后，放入1 mol·L-1的鹽酸中，在60 °C下解離10 min；經(jīng)解離的幼根用去離子水反復(fù)沖洗，再用改良的石炭酸品紅染液染色0.5～2 h后壓片，用普通光學(xué)顯微鏡(Leica，Germany)鏡檢；對所得圖像用Photoshop 5.0進(jìn)行處理分析。核型分析采用李懋學(xué)和陳瑞陽[15]的染色體分類標(biāo)準(zhǔn)，核型不對稱系數(shù)(As.K，%)按Arano[16]的方法計(jì)算，核型不對稱性采用Stebbins[17]的分類標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)品種(系)均選取16個(gè)細(xì)胞(4個(gè)根尖個(gè)體，每個(gè)根尖中選取4個(gè)細(xì)胞)，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1染色體核型分析 對染色體分散良好的細(xì)胞進(jìn)行觀察，并進(jìn)行染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)(表1)。野豌豆屬4個(gè)品種(系)的染色體數(shù)目均為2n=2x=12，二倍體，染色體基數(shù)為x=6。4個(gè)不同品種(系)的染色體核型參數(shù)見表2，染色體形態(tài)、核型圖和核型模式圖(Idiogram)見圖1。蘭箭3號的染色體數(shù)為2n=12，核型公式為2n=2x=8m+2sm+2st，在6對染色體中，第1、2、4、5對染色體為中部著絲點(diǎn)區(qū)染色體(m)，第3對染色體為近中部著絲點(diǎn)區(qū)染色體(sm)，第6對染色體為近端部著絲點(diǎn)區(qū)染色體(st)，未觀察到次縊痕和隨體；品系2556、2560的染色體數(shù)為2n=12，核型公式為2n=2x=10m+2sm，在6對染色體中，第1～5對染色體均為中部著絲點(diǎn)區(qū)染色體(m)，第6對染色體為近中部著絲點(diǎn)區(qū)染色體(sm)，未觀察到次縊痕和隨體；品種333/A的染色體數(shù)為2n=12，核型公式為2n=2x=2m+8sm (2SAT)+2st，在6對染色體中，第1、2、3、5對染色體均為近中部著絲點(diǎn)區(qū)染色體(sm)，第4對染色體為中部著絲點(diǎn)區(qū)染色體(m)，第6對染色體為近端部著絲點(diǎn)區(qū)染色體(st)，在3號染色體上的長臂端觀察到有1個(gè)隨體存在。

表1 野豌豆屬4個(gè)品種(系)的染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)Table 1 Number of chromosomes in four Vicia varieties (lines)

2.2野豌豆屬不同品種(系)的核型參數(shù)比較 根據(jù)Stebbins[17]的染色體核型分析和核型進(jìn)化方法，計(jì)算染色體長度比及染色體臂比大于2∶1的染色體所占百分比，由此判斷染色體核型類型。對4個(gè)品種(系)的核型參數(shù)進(jìn)行比較(表3)，結(jié)果顯示，雖然4個(gè)品種(系)的染色體數(shù)目相同，但其核型公式、染色體總長度、長度范圍、核型類型均不相同。蘭箭3號和品種333/A的染色體總長度分別為41.95和50.55 μm，而品系2556和2560的染色體總長度分別為44.11和43.07 μm。蘭箭3號和品種333/A的染色體絕對長度范圍分別為1.84～4.78和2.44～5.68 μm，而品系2556和2560的染色體絕對長度范圍分別為1.71～5.21和2.02～5.10 μm。蘭箭3號的染色體的長度比為2.60，臂比>2∶1的染色體占17%，故核型類型為“2B”；品系2556的染色體的長度比為3.04，臂比>2∶1的染色體占17%，故核型類型為“2B”；品系2560的染色體長度比為2.52，不存在臂比>2∶1的染色體，故核型類型為“1B”；品種333/A的染色體的長度比為2.33，臂比>2∶`1的染色體占83%，故核型類型為“3B”。蘭箭3號、品系2556、品系2560和品種333/A的核型不對稱系數(shù)分別為58.64%、58.49%、58.97%和70.15%。

3 討論

根據(jù)Stebbins[17]的染色體核型分析方法，野豌豆屬4個(gè)品種(系)染色體核型有“1B”、“2B”和“3B”3種類型，表明這4個(gè)品種(系)在進(jìn)化過程中處于較為進(jìn)化的地位。野豌豆屬4個(gè)品種(系)的染色體數(shù)目相同，均為2n=2x=12，未發(fā)生染色體數(shù)目改變，Sevimay等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，8個(gè)土耳其春箭筈豌豆品種的染色體數(shù)目均為2n=2x=12，Gaffarzade等[11]研究發(fā)現(xiàn)，春箭筈豌豆的亞種Viciasativasubsp.sativa和V.sativasubsp.nigra的染色體數(shù)目均為2n=2x=12，而毛野豌豆(V.villosa)的染色體數(shù)目為2n=2x=14，這表明在進(jìn)化過程中野豌豆屬內(nèi)植物發(fā)生了染色體數(shù)目的變異，而春箭筈豌豆未發(fā)生染色體數(shù)目變異。狹葉野豌豆品種333/A的核型特征與3種春箭筈豌豆的差異較大，其核型類型是相對最進(jìn)化的。品系2556和2560的核型特征比較相近，二者核型公式相同，染色體總長度、長度范圍和核型不對稱系數(shù)都比較接近，但二者的核型類型不相同，其中品系2556較為進(jìn)化。一個(gè)物種的核型特征即染色體數(shù)目、形態(tài)及行為的穩(wěn)定是相對的，種內(nèi)染色體的多態(tài)性是廣泛存在的現(xiàn)象，遺傳多樣性越豐富，物種進(jìn)化的潛力就越大；對環(huán)境改變的適應(yīng)能力越強(qiáng)，意味著物種自身的延續(xù)能力越強(qiáng)[19]。本研究和前人的研究結(jié)果共同表明，不同品種(系)春箭筈豌豆的核型特征存在著廣泛的差異，具有廣泛的遺傳多樣性，表明春箭筈豌豆這個(gè)物種在進(jìn)化中具有很大的潛力。

表2 野豌豆屬4個(gè)品種(系)的染色體核型參數(shù)Table 2 Chromosomal parameters of four varieties (lines) of Vicia karyotype analyses

陳軍和高清祥[7]發(fā)現(xiàn)，春箭筈豌豆品種333和333/A的核型公式均為2n=2x=2m+6st(2SAT)+4t,王建波等[6]發(fā)現(xiàn)狹葉野豌豆的核型公式為2n=2x=2sm+10st(2SAT),Frediani等[20]發(fā)現(xiàn)春箭筈豌豆的核型公式為2n=2x=2m+6sm(2SAT)+4st,而本研究發(fā)現(xiàn)春箭筈豌豆“蘭箭3號”的核型公式為2n=2x=8m+2sm+2st，品種333/A的核型公式為2n=2x=2m+8sm(2SAT)+2st，品系2556和2560的核型公式均為2n=2x=10m+2sm。表明野豌豆屬不同品種(系)在進(jìn)化中發(fā)生了染色體形態(tài)上的變異，具有染色體遺傳多樣性。根據(jù)Arano[16]關(guān)于核型進(jìn)化的觀點(diǎn)，核型不對稱系數(shù)越大，染色體越不對稱，物種越進(jìn)化。4個(gè)品種(系)的核型不對稱系數(shù)為品種333/A>品系2560>蘭箭3號>品系2556，所以說品種333/A是相對進(jìn)化的。Stebbins[17]關(guān)于核型進(jìn)化的分類標(biāo)準(zhǔn)為：“1A”型為最對稱型，“4C”型為最不對稱型，且核型比不對稱者較為進(jìn)化。品種333/A的核型類型為“3B”，是較為進(jìn)化的類型,“蘭箭3號”、品系2556的核型類型均為“2B”,品系2560的核型類型為“1B”，是較為原始的類型。陳軍和高清祥[7]發(fā)現(xiàn)春箭筈豌豆品種333和333/A的核型類型均為“3B”,Frediani等[20]發(fā)現(xiàn)春箭筈豌豆的核型類型為“3B”，這均與本研究中狹葉野豌豆品種333/A的核型類型一致,而王建波等[6]發(fā)現(xiàn)狹葉野豌豆的核型類型為“4B”。表明野豌豆屬在適應(yīng)環(huán)境的過程中，產(chǎn)生了多種變異，經(jīng)過長期的自然選擇，朝著更為適應(yīng)環(huán)境的方向進(jìn)化。

圖1 蘭箭3號(A1～A3)、品系2556 (B1～B3)、品系2560(C1～C3)和品種333/A(D1～D3)的染色體形態(tài)、核型圖和核型模式圖Fig.1 Morphology of somatic chromosomes and karyotypes, idiograms of V.sativa Lanjian No. 3 (A1-A3), V.sativa 2556 (B1-B3), V.sativa 2560(C1-C3) and V.angustifolia 333/A (D1-D3)

Alice等[10]發(fā)現(xiàn)春箭筈豌豆第2、3對染色體長臂端具隨體，Gaffarzade等[11]發(fā)現(xiàn)春箭筈豌豆的亞種V.sativasubsp.sativa第2、3對染色體長臂端具隨體，亞種V.sativasubsp.nigra第5對染色體長臂端具隨體,陳軍和高清祥[7]發(fā)現(xiàn)第3對染色體長臂端均具有隨體,而本研究發(fā)現(xiàn)狹葉野豌豆品種333/A第3對染色體長臂端具隨體，與前人的研究基本一致。另外，Alice等[10]還發(fā)現(xiàn)大花野豌豆(V.grandiflora)第2對染色體短臂端具隨體,褐毛野豌豆(V.pannonica)第1、2對染色體長臂端具隨體,法國豌豆(V.narbonensis)第4對染色體長臂端具隨體。從理論上講，無隨體的染色體核型是不能成立的，因?yàn)殡S體和核仁組成區(qū)(NOR)并存，而沒有NOR的細(xì)胞是不能生存的[21]。本研究在蘭箭3號、品系2556和2560染色體的研究中未發(fā)現(xiàn)隨體，是由于隨體太小無法分辨，還是在制片過程中丟失，有待進(jìn)一步的研究。另外，在Sevimay等[18]的研究中，8個(gè)土耳其春箭筈豌豆品種也均未發(fā)現(xiàn)隨體的存在。

表3 野豌豆屬不同品種(系)的核型參數(shù)比較Table 3 The karyotypic characters of different varieties (lines) Vicia

核型似近系數(shù)(Karyotype Resemblance-near Coefficient)是兩個(gè)物種在形態(tài)結(jié)構(gòu)上等同程度的表征，它反映物種間在核型上的同源性或親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。譚遠(yuǎn)德和吳昌謀[22]于1993年提出了核型似近系數(shù)聚類分析。1996年吳昌謀[23]又將此分析方法進(jìn)一步完善，提出了核型進(jìn)化距離的概念及計(jì)算方法，2005年李峰和潘沈元[24]開發(fā)了可運(yùn)行于PC機(jī)上的核型似近系數(shù)聚類分析軟件，這是一種根據(jù)核型似近系數(shù)的聚類分析方法，利用Visual Basic編制的核型似近系數(shù)的聚類分析軟件。因此，今后可以考慮采用核型似近系數(shù)分析軟件對不同品種(系)春箭筈豌豆進(jìn)行染色體核型比較，以期更準(zhǔn)確地研究不同品種(系)春箭筈豌豆間的相關(guān)性和在進(jìn)化中的關(guān)系。

遺傳多樣性的來源主要包括形態(tài)學(xué)性狀、染色體、蛋白質(zhì)、DNA等不同層次的變異，是生物多樣性的基礎(chǔ)和最重要的成分。已有關(guān)于箭筈豌豆形態(tài)學(xué)性狀[4]和RFLP分子標(biāo)記遺傳多樣性[25]的相關(guān)研究，因此，今后可以對不同品種(系)春箭筈豌豆進(jìn)行DNA分子水平變異的相關(guān)研究，如DNA序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA分析(RAPD)、微衛(wèi)星 DNA(Microsatellite DNA)分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)DNA分析(SSCP)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)等；另外，隨著測序新技術(shù)的發(fā)展，可開發(fā)春箭筈豌豆進(jìn)行特異分子標(biāo)記，這可進(jìn)一步加速春箭筈豌豆新品種的培育。

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