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    3份高羊茅材料吡咯琳-5-羧酸合成酶基因的結(jié)構(gòu)及酶活性比較

    2012-08-20 08:02:00冉雪琴王嘉福
    草業(yè)科學(xué) 2012年10期
    關(guān)鍵詞:高羊茅谷氨酸脯氨酸

    牛 熙,冉雪琴,王嘉福,2,陳 超

    (1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng)550025;2.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng)550025)

    吡咯琳-5-羧酸合成酶(Pyrroline-5-Carboxylate Synthetase,P5CS)是谷氨酸合成脯氨酸過程中的關(guān)鍵酶。P5CS有催化谷氨酸磷酸化和將谷氨酸-γ-半醛還原成吡咯琳-5-羧酸(Pyrroline-5-Carboxylate,P5C)兩種酶活性。P5C再由吡咯琳-5-羧酸還原酶(Pyrroline-5-Carboxylate Reductase,P5CR)催化,生成脯氨酸[1]。脯氨酸是植物主要的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)之一,干旱脅迫下P5CS基因的表達(dá)量上升,伴隨脯氨酸的合成增加[2],脯氨酸量的積累與植物的抗旱能力直接相關(guān)[3-4]。干旱脅迫下,轉(zhuǎn)P5CS 基因冰草(Agropyron cristatum)中游離脯氨酸量增加,細(xì)胞質(zhì)膜的通透性、丙二醛生成量增幅減緩,超氧化物歧化酶活性增高,抗旱能力明顯提高[5],轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotiana tabacum)、水稻(Oryza sativa)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)等植物中也發(fā)現(xiàn)類似的規(guī)律。高羊茅(Festuca arundinacea)是世界上重要的草坪草和牛羊等的優(yōu)質(zhì)飼草,抽穗期高羊茅中粗蛋白含量可超過11%[6]。黔草一號(hào)(Qiancao No.1,QC1)和黔草二號(hào)(Qiancao No.2,QC2)是貴州省草業(yè)研究所利用貴州野生高羊茅資源培育的高羊茅品種,兩個(gè)品種都有耐踐踏、易再生、適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。但這些培育的高羊茅品種P5CS 基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其與植株抗旱性的關(guān)系不甚明了。本研究主要分析人工培育的高羊茅品種P5CS基因結(jié)構(gòu)及其與抗旱性之間的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 高羊茅黔草一號(hào)(QC1)和黔草二號(hào)(QC2)均由貴州省草業(yè)研究所獨(dú)山實(shí)驗(yàn)基地提供,其中黔草二號(hào)分為黔草二號(hào)細(xì)葉(Qiancao No.2n,QC2n)和黔草二號(hào)寬葉(Qiancao No.2b,QC2b)。3份高羊茅材料均為生長(zhǎng)2年的成熟植株,株高15~17cm,栽種于口徑30cm、高24 cm的塑料花盆內(nèi)。實(shí)驗(yàn)于2011年9月在貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,干旱處理前1d澆透水,澆水量達(dá)到花盆上部不再向下滲水為止。停止?jié)菜?5d后,植株萎蔫,分別剪取3份高羊茅材料的葉片,用于脯氨酸含量及P5CS酶活性的測(cè)定。同時(shí)將部分葉片凍存于-80℃,用于RNA的提取。每份高羊茅材料設(shè)3個(gè)重復(fù)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 大腸桿菌(Escherichia coli TG1)為本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)藏菌株。

    1.3 主要試劑 pMD18-T vector購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;Gel Extraction Kit購(gòu)自 Omega公司;RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit為 MBI Fermentas公司產(chǎn)品;DNA Marker和質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自天根生物科技(北京)有限公司。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,核苷酸序列的測(cè)定由生工生物工程(上海)有限公司完成。

    1.4 P5CS 基因的克隆

    1.4.1 總RNA的提取 取1g葉片于液氮中研磨成粉,以酸酚-異硫氰酸胍-氯仿法提取總 RNA[9],1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量。

    1.4.2 P5CS 基因的克隆 參照小麥(Triticum aestivum,NCBI nucleotide accession no.AY888045)P5CS基因序列,設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物P1:5′-ATGGCCGGCGCCGACCCCAA-3′,P2:5′-AAGGAAGGCTCTTATGGGTGTA-3′,mu:5′-AAGGCTCCATATGAGGATTCAT-3′,md:5′-AATCTGGACCAAGGCATCA-3′。引物P1與md組合,預(yù)擴(kuò)增片段1 267bp,得到P5CS基因的上半段;引物P2和mu組合,預(yù)擴(kuò)增片段1 657bp,得到P5CS基因的下半段。

    取1μg總 RNA 按 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA,取1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的片段經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠回收,與pMD18-T載體連接過夜,構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1,涂布于IPTG和X-gal的氨芐LB瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)過夜。挑取白色單菌落,經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒PCR鑒定,選取陽(yáng)性克隆子測(cè)定核苷酸序列。

    1.4.3 P5CS基因的序列分析 應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行序列分析,通過NCBI的BLAST進(jìn)行核苷酸、氨基酸序列相似性檢驗(yàn),確定開放閱讀框(Open reading frame,ORF);采用瑞士生物信息研究所的蛋白分析系統(tǒng)(Expasy Protein Analysis System)對(duì)目的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)P5CS的理化性質(zhì)。以 MEGA 5.0軟件 Neighbor-Joining法分析系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)樹采用重復(fù)1 000次的自展檢驗(yàn)(Bootstrap Analysis)。編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)經(jīng)SWISS MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)在線分析。

    1.5 P5CS酶活性及脯氨酸含量測(cè)定 取干旱處理后3份高羊茅材料的葉片各1g,參照文獻(xiàn)[10]提取蛋白并測(cè)定P5CS蛋白酶的活性。采用磺基水楊酸法[11]測(cè)定干旱處理后3份高羊茅材料葉片中的脯氨酸含量。

    1.6 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 P5CS 基因的克隆 3份高羊茅材料總RNA經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),25S、18S和5SrRNA三組條帶清晰(圖1),提取的總RNA質(zhì)量良好無(wú)降解,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    圖1 甲醛瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品總RNA的質(zhì)量Fig.1 Total RNA detection by 1%formaldehyde-agarose gel electrophoresis

    分別以QC1、QC2n及QC2b總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增,經(jīng)檢測(cè),3份材料各獲得1 267和1 657 bp的兩種DNA片段,與預(yù)期大小相近(圖2)。

    2.2 P5CS 基因的序列分析 分別將QC1、QC2n和QC2b的P5CS基因擴(kuò)增片段克隆到T載體中,測(cè)序得到1 267和1 657bp兩種DNA片段。兩種片段間有781bp的重疊,拼接后得到2 151bp序列。與已知序列相比,3份高羊茅材料的2 151bp序 列 與 朝 鮮 堿 茅 (Puccinellia chinampoensis,HQ637435.1)的P5CS基因序列相似性最高,均為

    圖2 P5CS基因上半段(左)與下半段(右)的擴(kuò)增Fig.2 Amplification of P5CS gene fragments

    注:M 為DL2000DNA Marker;泳道1~3分別為 QC1、QC2n及QC2bP5CS基因上半段;泳道4~6分別為QC1、QC2b及QC2nP5CS基因下半段。

    Note:M,DL2000DNA Marker;Lane 1-3,5′-fragments of P5CSgene from samples QC1,QC2nand QC2b;Lane 4-6,3′-fragments of P5CSgene from samples QC1,QC2nand QC2b.94%,與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻、大麥(Hordeum vulgare)P5CS基因的相似性為68%~91%,編碼氨基酸序列的相似性為71%~96%(表1),說明3份高羊茅材料的2 151bp序列的確為P 5CS基因。2 151bp堿基序列為完整的ORF,編碼716個(gè)氨基酸殘基。將QC1、QC2b和QC2n的P5CS基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),3份高羊茅材料P5CS基因的核苷酸序列相似性為98%~99%,編碼氨基酸序列相似性均為99%。經(jīng)Expasy軟件分析,QC1的P5CS基因編碼蛋白的分子量為77.44kDa,等電點(diǎn)6.38;QC2n的P5CS基因編碼蛋白的分子量為77.40kDa,等電點(diǎn)6.19;QC2bP5CS 基因編碼蛋白的分子量77.30kDa,等電點(diǎn)5.96。

    以人類P5CS氨基酸序列為外群,將3份高羊茅材料的P5CS氨基酸序列與NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的100條P5CS氨基酸序列進(jìn)行聚類分析,從中選取有代表性的15個(gè)物種P5CS氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),QC1、QC2n、QC2b的P5CS與朝鮮堿茅相應(yīng)蛋白的親緣關(guān)系最近,與小麥、大麥及水稻、玉米(Zea mays)、高梁(Sorghum bicolor)、斑茅(Saccharum arundinaceum)及甘蔗(S.officinarum)聚為一類,而紫花苜蓿(Medicago sativa)、煙草、油菜(Brassica napus)及擬南芥聚為另一類。

    將QC1、QC2n和QC2b的P5CS氨基酸序列與擬南芥等植物的相應(yīng)序列進(jìn)行比較,3份材料的P5CS蛋白均含有兩種酶活性的功能區(qū),一種是谷氨酸激酶(Glu-5-Kinase,G5K),位于 P5CS蛋白的N端,另一種是谷氨酰半醛脫氫酶(Glutamyl 5-Phosphate Reductase,G5PR),位于P5CS蛋白的C端。其中G5K功能區(qū)包含ATP結(jié)合位點(diǎn)(ATP Binding Site)、亮氨酸結(jié)構(gòu)域(Conserved Leucine Domain)和谷氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(Glu-5-Kinase Domain,GK)。G5PR功能區(qū)包含NADPH結(jié)合位點(diǎn)(NADPH Binding Site)、預(yù)測(cè)的亮氨酸結(jié)構(gòu)域(Putative Leucine Domain)和氨酰半醛脫氫酶結(jié)構(gòu)域(GSA-DH Domain)(圖4)。

    表1 3份高羊茅材料與已知P5CS基因比較Table 1 Comparison of P5CS genes between three tall fescues and the known plants %

    圖3 以P5CS基因編碼氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(N-J法)Fig.3 Phylogenetic tree of P5CS amino acid sequence constructed by Neighbor-joining method with accession numbers

    圖4 高羊茅P5CS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Diagram of conserved domains in P5CS protein of tall fescue

    從QC1、QC2n和QC2bP5CS基因編碼的氨基酸序列中,找出6個(gè)氨基酸有差異(表2),主要位于P5CS的谷氨酸激酶(G5K)功能區(qū),其中2個(gè)位于ATP結(jié)合位點(diǎn)的N端,另外4個(gè)散布于ATP結(jié)合位點(diǎn)和亮氨酸結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域。谷氨酰半醛脫氫酶(G5PR)功能區(qū)的氨基酸序列完全相同。以SWISS-MODEL在線預(yù)測(cè) QC1、QC2n、QC2b和紫花苜蓿P5CS的谷氨酸激酶(G5K)功能區(qū)第13-281位氨基酸的三維結(jié)構(gòu),3種蛋白的谷氨酸激酶(G5K)功能區(qū)均由9個(gè)α螺旋和13個(gè)β片層組成。3份高羊茅材料P5CS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異主要由于第37、85及142位氨基酸所帶電荷發(fā)生了變化(表3、圖5)。與QC1、QC2n、QC2b的P5CS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)相比,紫花苜蓿P5CS蛋白也由9個(gè)α螺旋和13個(gè)β片層組成,有15個(gè)氨基酸所帶電荷發(fā)生了變化,二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的差異與P5CS蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸側(cè)基的帶電荷量有關(guān)。對(duì)比3份高羊茅材料及紫花苜蓿P5CS蛋白第68-175位區(qū)段氨基酸的帶電荷情況,紫花苜蓿帶電荷的氨基酸共28個(gè),其中帶正電荷的氨基酸13個(gè),帶負(fù)電荷的氨基酸15個(gè),帶正電荷的氨基酸占帶電荷氨基酸的46.2%,QC1、QC2n、QC2b中帶正電荷的氨基酸所占比例分別為44.8%、41.4%和37.9%,紫花苜蓿P5CS帶正電荷氨基酸的比例最大,帶負(fù)電荷氨基酸所占百分比最小,QC2b的P5CS帶正電荷氨基酸所占百分比最小,帶負(fù)電荷氨基酸所占比例最大(表3)。

    表2 QC1、QC2n和QC2bP5CS之間不同的氨基酸位點(diǎn)Table 2 Different amino acid sites in P5CS among QC1,QC2nand QC2b

    表3 高羊茅與紫花苜蓿P5CS蛋白第68-175位氨基酸區(qū)段帶電荷氨基酸的數(shù)量比較Table 3 Comparison of charged amino acid amounts from amino acid 68to 175of P5CS between tall fescues and alfalfa

    圖5 高羊茅P5CS谷氨酸激酶(G5K)結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)比較Fig.5 Comparison of deduced three-dimensional structure of G5Kdomain in P5CS protein of three tall fescues

    2.3 P5CS酶活性及脯氨酸含量的測(cè)定 取干旱處理后3份高羊茅材料的葉片,分別測(cè)定P5CS酶活性及其脯氨酸含量(圖6)。結(jié)果表明,QC1葉片的P5CS酶活性及其脯氨酸含量最高(P<0.01),QC2b的P5CS酶活性及其脯氨酸含量最低(P<0.01),QC2n的居中。

    3 討論

    本研究以QC1、QC2n、QC2b為3份實(shí)驗(yàn)材料,采用RT-PCR方法分別擴(kuò)增出P5CS基因。與已知序列相比,3個(gè)P5CS基因編碼的蛋白中均含有谷氨酸激酶功能區(qū)和谷氨酰半醛脫氫酶功能區(qū),這兩個(gè)功能區(qū)是高等植物P5CS蛋白的共有結(jié)構(gòu)。說明本研究克隆到的基因的確為P5CS基因并且結(jié)構(gòu)完整。

    圖6 QC1、QC2n、QC2b葉片的P5CS酶活性及其脯氨酸含量Fig.6 Activities of P5CS enzymes and contents of proline in leaves from tall fescues QC1,QC2nand QC2b

    P5CS是谷氨酸合成脯氨酸的關(guān)鍵酶,酶活性的高低直接影響植物脯氨酸的生成量。脯氨酸有助于提高植物的抗逆性[12-13]。對(duì)豇豆(Vigna unguiculata)P5CS基因進(jìn)行定點(diǎn)突變,使第129位氨基酸從苯丙氨酸(Phenylanlanine,Phe)突變?yōu)楸彼幔ˋlanine,Ala),則P5CS的酶活性和脯氨酸合成量上升[4]。對(duì)比3份高羊茅材料的P5CS氨基酸序列,在谷氨酸激酶(G5K)功能區(qū)有6個(gè)氨基酸不同,其中第37、85及142位氨基酸位于P5CS的第68-175位氨基酸區(qū)段,處于ATP結(jié)合位點(diǎn)和亮氨酸結(jié)構(gòu)域的中間區(qū)域,位于P5CS完整蛋白的外表面。ATP結(jié)合位點(diǎn)主要結(jié)合ATP,亮氨酸結(jié)構(gòu)域通過拉鏈結(jié)構(gòu)將P5CS兩個(gè)功能區(qū)相接,以維持P5CS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[14]。3份高羊茅材料P5CS蛋白第37、85及142位氨基酸的變異導(dǎo)致這些位點(diǎn)所帶電荷發(fā)生了變化,3個(gè)變異位點(diǎn)正處于亮氨酸結(jié)構(gòu)域的周圍,可能因此影響蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu),影響蛋白的酶活性。研究證實(shí),紫花苜蓿的抗逆性強(qiáng)于高羊茅,脯氨酸含量也高于高羊茅[15]。對(duì)比3份高羊茅材料QC1、QC2n、QC2b與紫花苜蓿P5CS蛋白的第68-175位氨基酸中帶電荷極性氨基酸的數(shù)量,紫花苜蓿帶正電荷的氨基酸百分比明顯高于本研究中的3份高羊茅材料。結(jié)合3份高羊茅材料P5CS酶活性及脯氨酸含量的測(cè)定結(jié)果,以及3份高羊茅材料中QC1的抗旱性最強(qiáng)等研究[16],推測(cè)第68-175位氨基酸區(qū)段正電荷氨基酸的數(shù)量增加可能提高P5CS的酶活性,增加脯氨酸的合成量,增強(qiáng)植物的抗旱能力;正電荷量下降/負(fù)電荷量增加則可能降低P5CS的酶活性,減少脯氨酸的合成量,抗旱能力也隨之下降。另外從葉型上看,高羊茅QC1的葉片最窄,QC2n其次,QC2b的葉片最寬。較窄的葉片散熱慢,蒸騰失水少[17],可能也是3份高羊茅抗旱性差異的原因之一。這些研究結(jié)果可為轉(zhuǎn)基因高羊茅植株的定向突變提供理論依據(jù),也有助于培育抗逆性更強(qiáng)的高羊茅品種和植物抗逆機(jī)理等研究。

    致謝:感謝貴州省草業(yè)研究所莫本田研究員提供的幫助。

    [1] Isabel P A,F(xiàn)rancisco C A,Ana I M,et al.Pyrroline-5-carboxylate synthase and proline biosynthesis:From osmotolerance to rare metabolic disease[J].Proteins,2010,3:372-382.

    [2] Yoshiba Y,Kiyoshue T,Katagiri T,et al.Correlation between the induction of a gene for P5CSand the accumulation of proline in Arabidopsis thaliana L.under osmitic stress[J].The Plant Journal,1995,7:751-760.

    [3] Kishor P B K,Hong Z,Miao G H,et al.Overexpression of pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline overproduction and confers osmotolerance in transgenic plants[J].Plant Physiology,1995,108:1387-1394.

    [4] Hong Z,Lakkineni K,Zhang Z H,et al.Removal of feedback inhibition of delta(1)-pyrroline-5-carboxylate synthetase results in increased proline accumulation and protection of plants from osmotic stress[J].Plant Physiology,2000,122(4):1129-1136.

    [5] 劉娟.轉(zhuǎn)基因冰草的生物學(xué)性狀和抗旱耐鹽性研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

    [6] 蘇加楷,張文淑,李敏.優(yōu)良牧草及栽培技術(shù)[M].北京:金盾出版社,2009:127-129.

    [7] 吳佳海,牟瓊,羅天瓊,等.抗逆高羊茅新品種黔草1號(hào)的特征特性[J].種子,2007(12):101-104.

    [8] 莫本田,羅天瓊,唐成斌,等.牧草新品種黔草2號(hào)葦狀羊茅的選育[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2006(4):79-81.

    [9] Sambrook J,Russell D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第三版.北京:科學(xué)出版社,2002:518-522.

    [10] Garcia-Rios M,F(xiàn)ujita T,Larosa P C,et al.Cloning of apolycistronic cDNA from tomato encodingγ-glutamyl kinase andγ-glutamyl phosphate reductase[J].Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A,1997,94:8249-8254.

    [11] 朱廣廉.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:北京大學(xué)出版社,1990:249-251.

    [12] Nolte K D,Hanson A D,Gage D A.Proline accumulation and methylation to proline betaine in citrus:Implication for genetic engineering of stress resistance[J].Journal of the American Society for Horticultural Science,1997,122:8-13.

    [13] 蔣明義,郭紹川,張學(xué)明.氧化脅迫下稻苗體內(nèi)積累的脯氨酸的抗氧化作用[J].植物生理學(xué)報(bào),1997,23:347-352.

    [14] Hu C A,Delauney A J,Verma D P.A bifunctional en

    zyme (delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase)catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A,1992,89:9354-9358.

    [15] 汪東.干旱地區(qū)高速公路邊坡生物防護(hù)技術(shù)研究[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

    [16] 羅紹薇,羅天瓊,劉正書.3種禾本科牧草抗旱性的初步鑒定[J].草業(yè)與畜牧,2007(11):17-21.

    [17] Gibson A C.Photosynthetic organs of desert plants[J].Bioscience,1998,48:911-920.

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