擬南芥山奈酚糖苷對UV-B輻射的響應(yīng)

牟曉飛，王 垠，李 敏，于 濤，楊玉煥

（東北林業(yè)大學鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室，哈爾濱 150040）

人類排放含氟氯烴和其他臭氧對抗物等行為會導(dǎo)致大氣平流層的臭氧衰減，從而使到達生物圈的UV-B輻射增加，并對陸地生物的生命活動產(chǎn)生影響，而合成紫外吸收物質(zhì)被認為是植物在生理生化層面抵御UV-B輻射傷害的有效防御機制[1-3]。黃酮類化合物（Flavonoids）作為一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，在植物防御UV-B輻射方面扮演著重要角色[4]。根據(jù)中央三碳鏈的氧化程度、成環(huán)與否等，將黃酮類化合物詳細分為13個大類即黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、花色素、黃烷醇、異黃酮、二氫異黃酮、查耳酮、橙酮、苯并色原酮、雙黃酮和高異黃酮等[5]。天然黃酮類化合物多為上述基本結(jié)構(gòu)的衍生物，在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成糖苷，少部分以游離形式存在[4]。

山奈酚和槲皮素是最常見的黃酮苷元，二者的衍生物在雙子葉植物中主要是以糖苷形式定位于表皮細胞的液泡中，發(fā)揮吸收紫外輻射的作用[6-7]。很多研究表明山奈酚糖苷在響應(yīng)UV-B輻射方面有積極作用。Fischbach等發(fā)現(xiàn)歐洲云杉（Picea abies）針葉液泡中的山奈酚-3-葡萄糖苷在針葉發(fā)育過程中逐漸被雙?；咸烟擒杖〈?，在表皮細胞壁處形成紫外屏蔽物質(zhì)，這種?；饔每墒蛊湮辗逡浦罸V-B波段，有利于防御UV-B輻射[8]。Kolb等在葡萄的一個種植品種（Vitis vinifera cv Silvaner）葉片中檢測到兩種山奈酚糖苷的總量受UV-B影響而增加[7]。Morales等發(fā)現(xiàn)垂直樺（Betula pendula）受UV-B輻射影響后葉片中山奈酚-3-鼠李糖苷的積累有升高趨勢[9]。研究發(fā)現(xiàn)伴隨UV-B輻射增強植物體內(nèi)槲皮素糖苷/山奈酚糖苷的比率升高，由此推斷在防御UV-B輻射方面槲皮素糖苷比山奈酚糖苷更為有效，但在UV-B輻射下山奈酚糖苷含量也增加的[10-12]。

研究表明，山奈酚糖苷對植物防御UV-B輻射有重要作用。Li等發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體tt4（黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶查耳酮合成酶功能缺失）與野生型相比缺少山奈酚衍生物，認為山奈酚衍生物的缺失可能是導(dǎo)致其UV-B輻射敏感性的原因[13]。Lois和Buchanan所使用的擬南芥突變體uvs（對UV-B輻射高度敏感，而對其他脅迫的響應(yīng)與野生型相同）僅缺乏一種山奈酚鼠李糖苷而其他酚類代謝產(chǎn)物正常[14]。其后研究較多地關(guān)注槲皮素糖苷/山奈酚糖苷的比率對UV-B輻射的響應(yīng)[15-16]，而未見報道分析山奈酚糖苷各組分對UV-B輻射的響應(yīng)差異及意義。

擬南芥中主要積累三種山奈酚糖苷，即山奈酚-3-O-鼠李葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（Kaempferol-3-O-rhamnosyl glucoside-7-O-rhamnoside）、山奈酚-3-O-葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（Kaempferol-3-O-glucoside-7-O-rhamnoside）和山奈酚-3-O-鼠李糖基-7-O-鼠李糖苷（Kaempferol-3-O-rhamnoside-7-O-rhamnoside）[17]。本文研究擬南芥山奈酚糖苷的組分及含量（組合模式）對UV-B輻射的響應(yīng)，并同時檢測山奈酚糖苷合成途徑關(guān)鍵酶編碼基因表達的變化，為進一步認識山奈酚糖苷在植物應(yīng)對UV-B輻射過程中的作用積累材料。

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)

哥倫比亞野生型（Columbia-0 ecotype）擬南芥種子購自擬南芥生物資源中心（Arabidopsis Biological Resource Center，US）。種子消毒沖洗后播種于1/2 MS培養(yǎng)基中，置于4℃黑暗環(huán)境中3 d打破休眠后移入自動控制溫室中培養(yǎng)，溫度20～25 ℃，光照 150 μmol·m-2·s-1，每天光照 16 h（6:00～22:00），空氣相對濕度50%～70%。選取長出2片子葉的幼苗和長至4片真葉的成苗用于試驗。

1.2 UV-B輻射處理與樣品采集

參照Hectors等的UV-B輻射處理方法[18]，在植物培養(yǎng)室內(nèi)使用日光燈管提供正常光照，使用Philips公司的UV-B燈管（TL20W/01RS，最大波長311 nm，波寬20 nm）進行UV-B輻射處理，UV-B燈管用0.13 mm厚度的醋酸纖維素膜濾除少量UV-C，每隔2 d更換1次，以保證輻照強度一致。

UV-B輻射處理的擬南芥幼苗（生長1周，2片子葉）和成苗（生長2周，4片真葉），每天在光周期（6:00～22:00）的11:00～17:00施以UV-B輻射，輻射強度40 μw·cm-2。連續(xù)處理7 d后，于第8天的11:00（UV-B處理前）、17:00（UV-B處理后）、22:00（光周期結(jié)束）、第9天的6:00（暗周期結(jié)束）計4個時間點采集葉片用于山奈酚糖苷和葉綠素含量測定，每個樣品至少3個重復(fù)。于17:00（UV-B處理后）采集葉片用于關(guān)鍵酶基因表達檢測。

1.3 葉綠素含量測定

采用Arnon方法測定葉綠素含量[19]，計算葉綠素a/b。

1.4 山奈酚糖苷含量測定

參照Li等方法提取擬南芥樣品中的山奈酚糖苷[13]。通過對比保留時間、紫外吸收光譜（200～400 nm）和相對峰面積初步判定擬南芥中含有三種山奈酚糖苷即山奈酚-3-O-鼠李葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（K1）、山奈酚-3-O-葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（K2）、山奈酚-3-O-鼠李糖基-7-O-鼠李糖苷（K3）。使用Agilent 1100 LC/MSD液相和離子阱質(zhì)譜聯(lián)用的增強分辨掃描和中性粒子丟失掃描模式，通過分析母離子質(zhì)量和相應(yīng)片段峰譜完成三種山奈酚衍生物的準確鑒定。利用Waters高效液相色譜（1525梯度洗脫泵、717自動進樣器、2487紫外檢測器）以山奈酚（Kaempferol，KA）為內(nèi)標測定山奈酚糖苷含量。使用Discovery C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；Supelco公司）以及流動相A（含0.01%冰乙酸的超純水）和流動相B（乙腈，色譜純）梯度洗脫，（0→5 min，0%B→7%B；6 min→20 min，7%B；21 min→45 min，7%B→22%B；46 min→55 min，22%B→100%B），流速 1.5 mL·min-1，檢測波長330 nm，進樣量20 μL。擬南芥幼苗和成苗的山奈酚糖苷樣品在330 nm檢測波長下的高效液相色譜圖如圖1所示。

圖1 擬南芥葉片中山奈酚糖苷的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of kaempferol glycosides in Arabidopsis

1.5 基因表達的檢測

采用Real-time PCR技術(shù)檢測山奈酚糖苷合成途徑中關(guān)鍵酶編碼基因fls1和chs表達水平（以actin2基因為內(nèi)參）。用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取樣品總RNA。按照TAIR數(shù)據(jù)庫提供的基因序列設(shè)計特異引物（見表1），引物均由上海生工有限公司合成。按照寶生物（大連）有限公司生產(chǎn)的Transcriptor First Strand cDNA synthesis kit試劑盒說明書合成全長cDNA第一鏈，加去離子水稀釋10倍作為模板，在DNA Engine Opticon2TM實時定量PCR儀上擴增。25 μL的PCR反應(yīng)體系中含有2 μL的cDNA模版，12.5 μL的SYBR Premix Ex TaqTM（2×），正向、反向引物各0.5 μL，超純水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃60 s、94℃20 s、55℃20 s、72℃20 s，45個循環(huán)，讀板溫度79℃。反應(yīng)結(jié)束后，采用Dissociation Curves Software（MJ Research Inc.）軟 件分析溶解曲線，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物長度以確定產(chǎn)物特異性。以actin2（At3g18780）為內(nèi)參，使用軟件Q-Gene計算fls1和chs基因相對表達量，軟件算法基于Muller等公式[20]。

表1 試驗所用引物Table 1 Forward and reverse primers used in Real-time PCR

1.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel和SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析，并采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）檢驗對照與處理之間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素a/b對UV-B輻射的響應(yīng)

葉綠體是植物光合作用的場所，也是自然界中光能吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換中重要的細胞結(jié)構(gòu)。UV-B輻射能夠破壞植物葉綠體結(jié)構(gòu)及其前體，或使葉綠素合成受阻從而降低葉綠素含量[21]。許多研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素a/b變化與UV-B輻射關(guān)系密切，并以葉綠素a/b作為衡量植物受損害情況的指標[21-24]。經(jīng)過7 d的UV-B處理后，無論是擬南芥幼苗還是成苗，葉綠素a/b與對照植株相比均無明顯差異，只有幼苗葉綠素a/b在UV-B處理結(jié)束時顯著低于對照植株，但經(jīng)光恢復(fù)、暗恢復(fù)階段后也回復(fù)至對照水平（見圖2）。這表明試驗采用的UV-B輻射強度對擬南芥植株的傷害程度未超出植株的自我修復(fù)能力，符合試驗設(shè)計要求，即在相對長期（7 d）、低強度的UV-B輻射下觀察山奈酚糖苷響應(yīng)。

圖2 擬南芥葉綠素a/b對UV-B輻射的響應(yīng)（平均值±標準差）Fig.2 Influence of UV-B radiation on the chlorophyll a/b change of Arabidopsis(mean±SD)

2.2 山奈酚糖苷含量對UV-B輻射的響應(yīng)

擬南芥幼苗和成苗山奈酚糖苷含量差異很大，幼苗山奈酚-3-O-鼠李葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（K1）、山奈酚-3-O-葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（K2）和山奈酚-3-O-鼠李糖基-7-O-鼠李糖苷（K3）的含量均為成苗10倍（見圖3、4）。

圖3 擬南芥幼苗山奈酚糖苷含量對UV-B輻射的響應(yīng)（平均值±標準差）Fig.3 Influence of UV-B radiation on the kaempferol glycosides content of young Arabidopsis seedlings(mean±SD)

經(jīng)過7 d的UV-B處理，擬南芥幼苗中三種山奈酚糖苷含量均高于未經(jīng)UV-B處理的對照植株，山奈酚糖苷表現(xiàn)為響應(yīng)UV-B輻射而積累（見圖3）。擬南芥成苗情況有所不同，UV-B處理植株在非UV-B處理時間特別是經(jīng)過暗周期恢復(fù)后，三種山奈酚糖苷含量與對照植株均無顯著差異，只是在UV-B處理及其后的光恢復(fù)階段才顯著高于對照植株，山奈酚糖苷含量未因連續(xù)7 d的UV-B處理而維持在一個顯著高于對照植株的水平（見圖4）。

圖4 擬南芥成苗山奈酚糖苷含量對UV-B輻射的響應(yīng)（平均值±標準差）Fig.4 Influence of UV-B radiation on the kaempferol glycosides content of mature Arabidopsis seedlings(mean±SD)

對應(yīng)于UV-B輻射處理以及光、暗周期的轉(zhuǎn)變，三種山奈酚糖苷含量都呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律。在擬南芥幼苗中，一日內(nèi)K1含量的變化最為明顯，UV-B處理導(dǎo)致K1含量急劇增加，而后在UV-B處理結(jié)束后的光恢復(fù)階段迅速下降到UV-B處理前水平，并在其后的暗周期中也維持在一個穩(wěn)定水平。K2、K3含量也有類似于K1的變化趨勢，但變化幅度很小。K2含量在一日中只有暗周期前、后的兩個采樣點之間差異顯著，而K3含量是暗周期結(jié)束時分別與暗周期開始時、UV-B處理結(jié)束時差異顯著。受UV-B輻射誘導(dǎo)，擬南芥幼苗K1含量提高163.35%，而K2和K3含量僅提高11.58%和17.35%（見圖3）。

擬南芥成苗中，三種山奈酚糖苷含量隨UV-B處理及光、暗周期變化的趨勢與幼苗相似，而且K2、K3含量變化也同K1一樣明顯，盡管它們的變化幅度（絕對數(shù)值）小于幼苗。一日內(nèi)三種山奈酚糖苷含量因UV-B處理都有較大幅度增加，K1、K2、K3含量分別提高91.61%、67.67%、94.22%，并在UV-B處理結(jié)束時達到峰值，隨后在光恢復(fù)階段迅速回落，至光周期結(jié)束時達到UV-B處理前水平（K3含量稍高），并維持到暗周期結(jié)束、新的光周期開始（見圖4）。

2.3 山奈酚糖苷合成關(guān)鍵酶基因表達對UV-B輻射的響應(yīng)

山奈酚糖苷的生物合成源于苯丙醇代謝途徑，在擬南芥中已較清楚[17]。在該途徑中，chs基因編碼的查耳酮合酶是山奈酚衍生物前期合成步驟中的關(guān)鍵控制酶，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核以及植物液泡膜中，能夠催化柚皮苷查耳酮的合成，也涉及到植物生長激素的極性運輸和根的向重力性的調(diào)節(jié)，chs功能缺失的tt4突變體不能合成山奈酚衍生物[13]；fls1基因編碼催化二氫黃酮生成黃酮醇的黃酮醇合酶，該酶能夠催化二氫山奈酚合成山奈酚，從而進一步形成山奈酚糖苷。根據(jù)TAIR擬南芥數(shù)據(jù)庫信息，本文采用Real-time PCR技術(shù)檢測UV-B處理結(jié)束時擬南芥中這兩個山奈酚代謝關(guān)鍵酶基因（chs和fls1）的表達水平，并與對照擬南芥進行比較，該時間點上的基因表達水平代表著基因?qū)V-B處理的響應(yīng)。對應(yīng)于UV-B處理，擬南芥幼苗、成苗chs和fls1基因的表達水平均表現(xiàn)為上調(diào)趨勢，除成苗fls1外均顯著高于對照植株。chs編碼的查耳酮合酶是山奈酚糖苷合成途徑中位于上游的關(guān)鍵酶，UV-B處理下chs表達水平的上調(diào)與三種山奈酚糖苷含量的增加是對應(yīng)的。位于山奈酚糖苷合成途徑下游的黃酮醇合酶，其編碼基因fls1表達水平對應(yīng)于UV-B處理的上調(diào)幅度相對小些，與山奈酚糖苷含量的增加不是很對應(yīng)，尤其是成苗中的情況（見圖5）。

圖5 擬南芥山奈酚糖苷合成關(guān)鍵酶基因表達對UV-B輻射的響應(yīng)（平均值±標準差）Fig.5 Expression profile of kaempferol glycosides metabolism related genes in response to UV-B radiation(mean±SD)

3 討論

植物應(yīng)對UV-B輻射最常見方式就是合成吸收紫外輻射的次生代謝產(chǎn)物如黃酮類化合物。植物中的黃酮類化合物多為其基本結(jié)構(gòu)的衍生物，并大部分是與糖結(jié)合成糖苷形式存在[4]。作為最常見黃酮類苷元之一的山奈酚，在雙子葉植物中以糖苷形式定位于表皮細胞的液泡中，起到吸收紫外輻射作用[6-7]，并有報道擬南芥、歐洲云杉、垂直樺等植物經(jīng)紫外輻射后山奈酚糖苷積累有增加趨勢[8-9,12]。本試驗對擬南芥連續(xù)7 d的UV-B輻射處理試驗表明，不僅山奈酚糖苷含量對應(yīng)UV-B處理有即時性增加，而且經(jīng)過7 d的處理后，擬南芥幼苗中山奈酚糖苷的積累水平也顯著高于對照植株。

本試驗對三種山奈酚糖苷組分即山奈酚-3-O-鼠李葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（K1）、山奈酚-3-O-葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（K2）和山奈酚-3-O-鼠李糖基-7-O-鼠李糖苷（K3）的具體分析表明，它們應(yīng)對UV-B輻射的變化并不是一致的。在擬南芥幼苗中，K1含量應(yīng)對UV-B輻射的即時性變化幅度較大，而K2、K3含量變化幅度很小（見圖3）。在擬南芥成苗中，K1、K3含量變化幅度要大于K2含量變化幅度（見圖4）。Lois等研究表明，缺失一種山奈酚鼠李糖苷的擬南芥突變體uvs表現(xiàn)出對UV-B的高度敏感[14]?？梢?，不僅要分析山奈酚糖苷總量，還要深入分析山奈酚糖苷各組分及含量即組合模式的變化，對于認識山奈酚糖苷在植物應(yīng)對UV-B輻射過程中的作用具有重要意義。

研究表明，擬南芥幼苗中三種山奈酚糖苷含量是成苗10倍，且經(jīng)過7 d的UV-B輻射處理后，幼苗中山奈酚糖苷積累水平顯著高于對照，而成苗中卻不同。在對擬南芥芥子酸酯的研究中也發(fā)現(xiàn)類似情況，并推斷擬南芥芥子酸酯對于UV-B輻射的防護作用，幼苗屬于組成型防御（Constitutive defense），而到成苗則轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)型防御（Inducible defense）。山奈酚糖苷是否屬于這種情況，還有待于進一步探討。

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