缺氧對大鼠心肌細胞系H9C2中HIF-1α、CT-1表達的影響

王 晗，符史干，董戰(zhàn)玲，許閩廣，王 楊，陳國斌，高凌峰

(海南醫(yī)學院生理學教研室，海口571101)

缺氧誘導因子(HIF-1)是哺乳動物細胞在缺血/缺氧情況下產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，可促進下游缺氧反應基因如促紅細胞生成素(EPO)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、細胞周期素G2、血紅素氧合酶-1 (HO-1)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等的表達，增強組織細胞抵抗缺血、缺氧的能力［1，2］。HIF-1由α亞基和β亞基組成，其中對HIF-1活性的調(diào)節(jié)主要通過α亞基。心肌營養(yǎng)素-1(CT-1)是新近發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子，屬于 IL-6超家族，可通過 JAK/ STAT3、MAPK-MEK/ERK、PI3-K/Akt等信號途徑發(fā)揮保護心肌細胞的作用。缺氧時HIF-1與CT-1的關系尚不清楚，2010年1月～2011年4月我們檢測了缺氧時大鼠心肌細胞系H9C2中HIF-1和CT-1的表達情況，從而為探討缺血心肌中HIF-1與CT-1的關系提供方法與思路。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基、TRIzol購自Invitrogen公司;CCK-8試劑盒購自廣州研創(chuàng)生物技術發(fā)展有限公司;HIF-1α抗體，CT-1抗體，actin抗體購自Santa Cruz公司;PCR相關試劑購自博大泰克公司;氯化鈷(CoCl2)購于海南青鳥生物科技有限公司;大鼠心肌細胞系H9C2購自上海越研生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與低氧孵育 大鼠心肌細胞系H9C2使用DMEM培養(yǎng)液(加入10%胎牛血清)，放置于37℃、5%CO2孵箱中。低氧環(huán)境通過在培養(yǎng)基中加入CoCl2實現(xiàn)。

1.2.3 細胞活性檢測 H9C2細胞活性通過CCK-8試劑盒檢測。種植于96孔板的細胞，按照每孔100 μL培養(yǎng)基加入10 μL CCK-8溶液的比例進行孵育，2 h后檢測OD450。

1.2.4 HIF-1α及 CT-1 mRNA檢測 Real-time PCR法檢測缺氧前后H9C2細胞中HIF-1α和CT-1的基因水平。CoCl2處理H9C2細胞48 h后提取RNA檢測HIF-1α和CT-1的基因表達量。細胞總RNA提取采用TRIzol試劑提取法，具體方法參照說明書。RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應合成 cDNA，Real-time PCR擴增過程及熒光信號檢查、數(shù)據(jù)的儲存和分析均由儀器(ABI Prism 7300 sequence detection system)及自帶的SDS軟件自動完成。actin作為內(nèi)對照來評估HIF-1和CT-1 mRNA的表達。

1.2.5 HIF-1α及CT-1蛋白檢測 Western blot法檢測缺氧前后H9C2細胞中HIF-1α和CT-1的蛋白表達量的變化。CoCl2處理48 h后收集細胞，冷PBS洗滌，加入細胞裂解液各200 μL，經(jīng)8%SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，蛋白封閉液4℃封閉膜過夜;加入鼠抗人HIF-1α單克隆抗體(1∶500)，室溫搖床孵育2 h，應用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠多克隆抗體(1∶1 000)室溫孵育1 h，再加入化學發(fā)光顯色劑顯色，X光片曝光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描。CT-1蛋白水平檢測方法同HIF-1。actin作為內(nèi)對照。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，配對組間比較采用t檢驗，以P≤0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 使用CoCl2后H9C2細胞的增殖情況 對照組(培養(yǎng)液中無CoCl2)模擬缺氧第1、2、3、4天后的OD值分別為0.220±0.007、0.350±0.055、0.670 ±0.060、0.870±0.053，缺氧組(培養(yǎng)液中加入100 μmol/L的CoCl2)分別為0.220±0.014、0.360± 0.028、0.530±0.047、0.700±0.051。對照組和缺氧組OD值都呈上升趨勢，加CoCl2模擬缺氧第1、2天后OD值與對照組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，加CoCl2第 3、4天后 OD值較對照組降低(P均＜0.05)。

2.2 HIF-1及CT-1 mRNA表達 缺氧組和對照組H9C2細胞中HIF-1α mRNA都有表達(分別為2.90 ×10-3±0.000 5和2.72×10-3±0.000 6)，但缺氧時HIF-1α mRNA較對照組無明顯差別(P＞0.05)。CT-1 mRNA在常氧和缺氧條件下也都有表達(分別為3.48×10-4±0.000 08和6.19×10-4±0.000 07)，但缺氧后CT-1 mRNA水平增高(P＜0.05)。

2.3 HIF-1及CT-1蛋白表達 Western blot結果顯示，對照組即常氧情況下HIF-1α蛋白幾乎沒有表達，缺氧后HIF-1α蛋白表達增加(P＜0.05)。CT-1蛋白在常氧和缺氧條件下也都有表達，缺氧后CT-1蛋白水平明顯增高(P＜0.05)，見圖1。

圖1 模擬缺氧后H9C2細胞中HIF-1α及CT-1蛋白表達

3 討論

在全世界范圍內(nèi)缺血性心臟病的發(fā)病率和病死率逐年攀升，盡管目前經(jīng)皮冠狀動脈介入術等治療已得到廣泛應用，部分患者仍無法完全重建血運。研究者們努力尋找新的治療靶點。心肌缺血會導致心肌缺氧，在體外，缺氧的環(huán)境可以通過使用低氧孵箱和使用CoCl2來實現(xiàn)［3］。本研究采用向培養(yǎng)液中加100 μmoL/L CoCl2模擬缺氧。結果顯示CoCl2模擬的缺氧環(huán)境使心肌細胞系H9C2存活率較常氧時下降。

氧是機體維持生存的必要因素，整體或局部缺氧會引起機體產(chǎn)生一系列適應性反應，這些反應與缺氧誘導產(chǎn)生的HIF-1密切相關，HIF-1作為一種轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)一系列基因的轉(zhuǎn)錄，從而維持機體的功能［4］。HIF-1的 α和 β兩個亞單位都屬于bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族。細胞內(nèi)氧的水平能夠調(diào)節(jié)α亞單位的穩(wěn)定性、亞細胞定位和其促轉(zhuǎn)錄的功能;而β亞單位在細胞核中持續(xù)表達，其活性不受缺氧的影響。α和β亞單位結合后才能發(fā)揮促進基因轉(zhuǎn)錄的作用。在常氧情況下，α亞單位能通過腫瘤抑制蛋白介導的泛素—蛋白酶途徑被迅速降解，而缺氧能阻斷這一途徑，使HIF-1α單位穩(wěn)定下來［5，6］。因此，本研究中向培養(yǎng)液中加100 μmol/L CoCl2模擬缺氧后，H9C2細胞中HIF-1α的蛋白水平增加，而HIF-1α的mRNA水平與常氧比較沒有變化，這與理論上保持一致。據(jù)研究表明，HIF-1在心肌缺血時主要通過促進EPO、VEGF、HO-1、iNOS等基因的表達發(fā)揮代償作用［7］。除此之外，在心肌缺血缺氧時，HIF-1是否還可以通過促進其他與心肌保護密切相關因子的表達發(fā)揮代償作用，值得探討。

CT-1是1995年Pennica等［8］從小鼠心臟發(fā)育的胚胎干細胞中克隆表達出的一種因子，為白細胞介素6細胞因子家族的新成員，因其在體外能夠?qū)е滦募〖毎蚀蠖妹?］。CT-1除可促使心肌細胞肥大外，還有促進心肌細胞存活的作用［10］。近年來，CT-1在心肌受損保護方面的作用受到廣泛的關注。CT-1在心肌缺血缺氧情況下表達增加，發(fā)揮心肌保護作用，其調(diào)控機制是什么，目前尚不明確。有研究表明CT-1在小鼠胚胎細胞中受HIF-1的調(diào)控［11］，但在缺氧的心肌細胞中CT-1是否受到HIF-1的調(diào)控尚未闡明。本研究結果顯示CoCl2模擬缺氧后大鼠心肌細胞系H9C2中CT-1 mRNA和蛋白水平都增加，伴隨著HIF-1蛋白水平的增加而增加，提示在缺氧心肌中HIF-1與CT-1可能存在一定的關系。在缺氧心肌中，缺氧會誘導心肌細胞中HIF-1α蛋白增加，HIF-1α和 HIF-1β結合可能通過促進CT-1基因的轉(zhuǎn)錄來促進CT-1蛋白的表達。但心肌缺氧時CT-1是否確實受HIF-1的調(diào)控，還有待于進一步研究。

本研究為缺氧情況下心肌的代償機制提供新的見解和實驗資料，對揭示缺氧情況下心肌細胞自身調(diào)控有重要的生物學意義，對治療缺血性心臟病提供新的思路和重要的實驗佐證。

［1］Carmeliet P，Dor Y，Herbert JM，et al.Role of HIF-1alpha in hypoxia-mediated apoptosis，cell proliferation and tumour angiogenesis［J］.Nature，1998，394(6692):485-490.

［2］Monti E，Gariboldi MB.HIF-1 as a target for cancer chemotherapy，chemosensitization and chemoprevention［J］.Curr Mol Pharmacol，2011，4(1):62-77.

［3］Wang G，Hazra TK，Mitra S，et al.Mitochondrial DNA damage and a hypoxic response are induced by CoCl(2)in rat neuronal PC12 cells［J］.Nucleic Acids Res，2000，28(10):2135-2140.

［4］Adams JM，Difazio LT，Rolandelli RH，et al.HIF-1:a key mediator in hypoxia［J］.Acta Physiol Hung，2009，96(1):19-28.

［5］Wang GL，Jiang BH，Rue EA，et al.Hypoxiainducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(12):5510-5514.

［6］Lee JW，Bae SH，Jeong JW，et al.Hypoxia-inducible factor(HIF-1)alpha:its protein stability and biological functions［J］.Exp Mol Med，2004，36(1):1-12.

［7］Tekin D，Dursun AD，Xi L.Hypoxia inducible factor 1(HIF-1) and cardioprotection［J］.Acta Pharmacol Sin，2010，31(9):1085-1094.

［8］Pennica D，Swanson TA，Shaw KJ，et al.Human cardiotrophin-1: Protein and gene structure biological and binding activities，and chromosomal localization［J］.Cytokine，1996，8(03):183-189.

［9］韓紅亞，周玉杰，卜聰亞.心肌營養(yǎng)素-1與心血管系統(tǒng)關系的研究進展［J］.心肺血管病雜志，2011，30(2):165-167.

［10］Ruixing Y，Jinzhen W，Dezhai Y，et al.Cardioprotective role of cardiotrophin-1 gene transfer in a murine model of myocardial infarction［J］.Growth Factors，2007，25(4):286-294.

［11］Ateghang B，Wartenberg M，Gassmann M，et al.Regulation of cardiotrophin-1 expression in mouse embryonic stem cells by HIF-1alpha and intracellular reactive oxygen species［J］.J Cell Sci，2006，119(6):1043-1052.