溶出伏安法測定血清中維生素K3

史學(xué)麗，左志宇，王 方，魏翠梅，周寶寬

（1.天津醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室，天津300070；2.天津市蘭立科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司，天津300384）

維生素K3（vitamin K3,VK3），化學(xué)名2-甲基-1,4-萘醌，主要用于治療VK缺乏引起的凝血酶原過多癥，并參與人體的鈣代謝[1]，近年來人們對VK3的關(guān)注集中在它能抑制癌細胞的作用上[2-3]，由于它對于人體的不可缺少性，一直是醫(yī)學(xué)界、電化學(xué)界非常感興趣的研究對象。目前報道的VK3的檢測方法有高效液相色譜法[4]、分光光度法[5-6]、極譜法[7]、電化學(xué)發(fā)光淬滅法[8]等。這些方法各有優(yōu)點，但有的儀器昂貴、測定繁瑣，有的靈敏度低，并且VK3的化學(xué)性質(zhì)活潑，見光易變性，需要快速測定，而高效液相色譜儀很難達到要求。近年來電化學(xué)方法由于其靈敏度高、選擇性好、快速經(jīng)濟等優(yōu)點，在分析領(lǐng)域得到了廣泛地應(yīng)用[9-10]，但采用電化學(xué)方法對人血清中VK3的測定尚少見報道。本文采用差分脈沖溶出伏安法[11]對血清中的VK3含量進行了測定并與高效液相色譜法進行了比對。

1 材料和方法

1.1 主要儀器 LK2006電化學(xué)工作站（天津蘭立科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司）；三電極體系：玻碳電極（GCE，A-0.1256cm2）為工作電極，Ag/AgCl電極參比電極、鉑片電極為對電極；Agilent 1100HPLC工作系統(tǒng)（Agilent公司，美國）。

1.2 試劑 VK3（批號：100029-200009）購自中國藥品生物制品檢定所；鍍汞液自配；甲醇、氯仿為色譜純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；氨水、氯化銨等試劑皆為分析純；實驗用水為二次去離子水。

鍍汞液的配制：精密稱取硝酸汞0.3246g，用1∶1硝酸（1～2mL）溶解，然后用二次去離子水定容至1L容量瓶中，配成濃度為10-3mol·L-1的溶液。

1.3 VK3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取50.00mgVK3標(biāo)準(zhǔn)品溶于適量無水乙醇中，定容至100mL棕色容量瓶，暗處避光保存，使用時稀釋成所需濃度的溶液。

1.4 血清樣品預(yù)處理 將3mL正常人血樣品置5mL的塑料離心管中，高速離心10min（4000r/min），取上清液2mL于40℃水浴上用氮吹儀吹干，殘渣用2mL NH3·H2O/NH4Cl緩沖液（1.0mol·L-1）溶解待測，色譜法用三氯甲烷溶解殘渣。

1.5 色譜條件及測定 色譜柱：Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫：室溫；檢測波長：250nm；流動相：甲醇∶水=65∶35；流速：1.0mL·min-1；進樣量：20μL。稱取一定樣品于10mL棕色容量瓶中，用甲醇-水（65/35，V/V）定容，超聲振蕩10min，離心，供進樣用。

1.6 鍍汞膜玻碳電極的制備 玻碳電極用HNO3溶液（1+1）浸泡拋光后，依次用無水乙醇、去離子水超聲清洗，吸干電極表面水分并在空白底液（1mol·L-1NH3·H2O/NH4Cl）中掃至無峰，然后以鉑片電極為對電極，Ag/AgC1電極為參比電極，將三電極置于鍍汞液中，在電流-35μA、間隔時間0.01s、采樣點數(shù)30000條件下鍍汞膜，制得汞膜玻碳電極。

1.7 VK3的測定 以汞膜玻碳電極與對電極鉑片電極、參比電極Ag/AgC1組成三電極體系，以pH=9.4的1.0mol·L-1的氨水-氯化銨緩沖溶液為底液[11]，加入一定量VK3標(biāo)準(zhǔn)品溶液，設(shè)置初始電位-10mV，終止電位-700mV，電位增量0.005V，脈沖寬度0.05s，脈沖幅度20mV，脈沖間隔0.1s，電沉積時間45s，平衡時間15s，在-10～-700mV范圍內(nèi)進行差分脈沖溶出伏安掃描，記錄峰電流及峰電位。

2 結(jié)果

2.1 實驗條件的選擇

2.1.1 底液的選擇 選用氨水-氯化銨緩沖液作為底液，發(fā)現(xiàn)VK3在1.0mol·L-1（pH=9.4）的氨水-氯化銨緩沖液中在-0.224V處左右出峰，峰形好，靈敏度高。見圖1。

2.1.2 pH對峰值的影響 在氨水-氯化銨緩沖溶液中在不同的pH值條件下進行掃描，發(fā)現(xiàn)VK3在pH= 9.4的氨水-氯化銨緩沖液中靈敏度最高，因此以下的研究均采用pH=9.4的氨水-氯化銨緩沖溶液。

2.1.3 富集時間對峰高的影響 對0.46ng·mL-1濃度的VK3進行測定，發(fā)現(xiàn)隨著富集時間的提高，峰電流增加，峰形趨于整齊，富集時間超過40s，峰電流變化不大甚至下降，峰形出現(xiàn)明顯拖尾，因此選擇富集時間為40s，見圖2。

圖1 VK3在氨水-氯化銨緩沖液中的掃描圖Fig 1 Scanogram of VK3in the buffer of NH3·H2O/NH4Cl

圖2 富集時間T對峰電流ip的影響Fig 2 The influence of peak electric current ipfrom accumulation time T

2.2 重現(xiàn)性 在選定的最佳實驗條件下對濃度為0.92ng·mL-1的VK3標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在24h內(nèi)測定6次，根據(jù)實驗結(jié)果計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.64%，重現(xiàn)性良好。

2.3 線性范圍和檢出限 取2mL濃度為1.0mol·L-1氨水-氯化銨空白緩沖液分別加入5、10、15、20、25、30、35μL VK3標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測試體系相應(yīng)的濃度為0.23、0.46、0.69、0.92、1.2、1.4、1.6ng·mL-1，按上述1.6的測定方法，測定VK3的含量，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以VK3的濃度為橫坐標(biāo)，峰電流為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法進行回歸計算。線性方程為：Y=0.072X-0.280，r2=0.999，表明濃度在0.23～1.6ng·mL-1內(nèi)，與峰電流值呈良好的線性關(guān)系，最低檢測限位0.23ng·mL-1。見圖3。

2.4 回收試驗 取一定量含量VK3的正常人血清共3份，按1.4方法處理，測定VK3的濃度為C1，然后加入一定量標(biāo)準(zhǔn)品（大約分別相當(dāng)于VK3含量的80%、100%、120%），測定血清和VK3標(biāo)準(zhǔn)品混合物的濃度為C2，每份各測定3次，計算回收率為99.91%，RSD為1.03%（n=9）。

圖3 VK3標(biāo)準(zhǔn)品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 3 The standard curve of the solution of standard substance VK3

2.5 血液樣品中VK3的測定 取適量血液樣品按1.4方法進行處理，在上述的測試條件下對6個樣本進行測定，每樣本測定3次代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。另取同批樣品，按高效液相法測定，結(jié)果見表1。

表1 血清中VK3含量測定結(jié)果Tab 1 Determination result of VK3in seurn

3 討論

近20年來，國內(nèi)外的電化學(xué)分析測試儀器得到了蓬勃發(fā)展。1992年，朱果逸等[12]就曾對國外電化學(xué)分析儀器的進展進行過總結(jié)。目前，國外已有多家公司生產(chǎn)了多種系列的電化學(xué)分析測試系統(tǒng)/工作站。雖然從整體上看國內(nèi)的電化學(xué)分析測試儀器較之國外產(chǎn)品尚有差距，但近年來國內(nèi)的研究、開發(fā)、生產(chǎn)還是比較活躍的。20世紀(jì)80年代，現(xiàn)代電子技術(shù)和微機與電化學(xué)方法結(jié)合，建立了微機聯(lián)用電化學(xué)分析測試系統(tǒng)，使我國的電化學(xué)分析測試儀器的發(fā)展步入了一個新的階段；20世紀(jì)90年代后期，其發(fā)展逐漸邁向成熟，硬件集成化，軟件程序模塊化、多樣化，并集多種功能為一體。這些進步使電化學(xué)儀器的測量速度、精度、準(zhǔn)確度、分辨率得到較大提高，為電化學(xué)家提供了更為有效的研究方法，同時也促進了電化學(xué)分析儀器的廣泛應(yīng)用。

本文采用溶出伏安法測定血清中VK3的含量，之前也有對用此方法測定VK3的報道[11]。鑒于血清中影響測定的因素多，測定結(jié)果重現(xiàn)性差等原因，我實驗室采用預(yù)鍍汞膜玻碳電極，對電極進行了修飾，結(jié)果顯示用修飾技術(shù)三電極伏安法測定溶液中VK3含量，與高效液相色譜法、紫外分光光度法等測定方法相比較，其各有優(yōu)點和不足，但該方法建立在電化學(xué)實驗手段的基礎(chǔ)上，其方便快捷、簡單易行、安全且代價小是顯而易見的。做為提供一種新的測試方法和技術(shù)手段，具有一定的借鑒價值和創(chuàng)新意義。正是基于這一點，缺陷和不足也是在所難免的，有進一步探索和完善的必要。

目前對VK3的測定以高效液相色譜法居多，其優(yōu)點在于測定結(jié)果準(zhǔn)確并且可以將VK3的同分異構(gòu)體進行分離，但無法減少VK3在測定過程中發(fā)生氧化，所以縮短測定時間、避免光照是減少氧化的必要措施。實驗結(jié)果表明電化學(xué)工作站檢測結(jié)果的RSD均明顯小于Aiglent1100高效液相色譜法，表明電化學(xué)工作站的檢測精密度高、重復(fù)性好；電化學(xué)工作站的檢測值普遍比Aiglent1100高效液相色譜法高，其可能原因（1）VK3化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，而高效液相色譜法測定時間長，可能致使少量VK3變性。（2）高效液相色譜法中采用三氯甲烷做溶劑溶解VK3，較之電化學(xué)工作站中用無水乙醇的溶解效果稍差。但電化學(xué)法的抗干擾能力相比高效液相色譜會稍顯不足，對條件的要求嚴(yán)格，這是今后要克服的問題。

通過上述研究建立了差分脈沖溶出伏安法分析測定血清中VK3的方法，該方法操作簡便，檢測靈敏度高，檢出限達0.23ng·mL-1；測定結(jié)果準(zhǔn)確度高，回收率為99.91%，RSD＜5%。含量測定方法學(xué)考察研究表明，采用預(yù)鍍汞膜電極的差分脈沖溶出伏安法測定VK3的含量，方法穩(wěn)定可行，并且由于其測定時間短，取樣少，成本低，靈敏，快速，因此可用于臨床普及。

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