Na＋／Ca2＋交換體α－2（807－844）抗體的制備及其對大鼠心肌細(xì)胞Na＋／Ca2＋交換電流的抑制作用1）

趙 雷，李明華，楊嘯燕，高亞男，封啟龍，吳博威

Na＋／Ca2＋交換體（Sodium－calcium exchanger，NCX）是心肌細(xì)胞膜上一類重要的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，于1968年由Reuter和Seitz在豚鼠心房肌細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)［1］。NCX主要介導(dǎo)3個Na＋和1個Ca2＋的反向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)運(yùn)方向取決于細(xì)胞膜兩側(cè)Na＋和Ca2＋的濃度以及當(dāng)時的膜電位。在生理?xiàng)l件下，NCX作為心肌細(xì)胞鈣外排的主要機(jī)制已被廣泛接受［1］。一般認(rèn)為，由電壓依賴性鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鈣離子主要就是通過NCX被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外的［2，3］。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)電生理技術(shù)的結(jié)合與應(yīng)用，對心肌NCX的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系有了更加深入的認(rèn)識。點(diǎn)突變研究和氨基酸替代實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NCXα－2（807－844）可能參與構(gòu)成Na＋和Ca2＋轉(zhuǎn)運(yùn)的通路，因而在NCX的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及與某些阻斷劑的結(jié)合中發(fā)揮重要作用，如Na＋、Ca2＋、Ni2＋、Li＋和KB－R7943等［4，5］。既然α－2（807－844）肽段是NCX發(fā)揮功能的關(guān)鍵部位，那么針對它的抗體就有可能對NCX的離子轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要作用。本研究在制備抗α－2（807－844）肽段抗體的基礎(chǔ)上，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察抗體對大鼠心肌細(xì)胞Na＋／Ca2＋交換電流（INa／Ca）、L型鈣電流（ICa－L）、瞬時外向鉀電流（Ito）和內(nèi)向整流鉀電流（Ik1）的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠質(zhì)量（250±10）g，雌雄不限，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；健康大耳長白家兔質(zhì)量（2 500± 100）g，雌雄不限，由北京市海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場提供。

1.2 主要藥品與試劑 哇巴因、牛磺酸、L－谷氨酸、天門冬氨酸鉀、Cs－EGTA、CsOH、尼卡地平、EGTA、Na2－GTP、HEPES、TEA、Na2－GTP、NMDG、ATP－K2、Na2－GTP、ATP－Mg、磷酸肌酸鈉鹽、4－AP由Sigma公司提供。膠原酶P（Collagenase P）由德國Bochringer Mannhein公司提供。

1.3 主要溶液配制

1.3.1 臺氏液 Glucose 10mmol／L，NaH2PO40.33mmol／L，KCl 5.4mmol／L，MgCl21.0mmol／L，NaCl 140mmol／L，CaCl21.8mmol／L，HEPES 5.0mmol／L，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.38。1.3.2 酶液 KCl 5.4mmol／L，MgCl21.0mmol／L，NaCl 125 mmol／L，HEPES 10mmol／L，NaH2PO40.33mmol／L，Glucose 10mmol／L，Taurine 20mmol／L，膠原酶P 0.08mg／mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.38。

1.3.3 KB液 KCl 30mmol／L，L－谷氨酸50mmol／L，EGTA 0.5mmol／L，HEPES 10mmol／L，?；撬?0mmol／L，Glucose10mmol／L，MgCl21.0mmol／L，KH2PO430mmol／L，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.38。

1.3.4 Na＋／Ca2＋交換電流電極液 細(xì)胞內(nèi)液：磷酸肌酸鈉鹽5.0mmol／L，4－AP 20mmol／L，MgCl213mmol／L，EGTA 42 mmol／L，CaCl229mmol／L，HEPES 5.0mmol／L，天門冬氨酸鉀42mmol／L，ATP－K210mmol／L，用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.3。細(xì)胞外液：BaCl21.0mmol／L，CaCl21.8mmol／L，Glucose10 mmol／L，MgCl22.0mmol／L，HEPES 5.0mmol／L，NaCl 140 mmol／L，CsCl 2mmol／L，哇巴因20μmol／L，尼非地平1μmol／L，用CsOH調(diào)節(jié)PH至7.38。

1.3.5 L型鈣電流電極液 細(xì)胞內(nèi)液：MgCl22mmol／L，CsCl 130mmol／L，HEPES 10mmol／L，ATP－Mg 3EGTA 15mmol／L，Glucose 10mmol／L，用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.2。細(xì)胞外液：Glucose 10mmol／L，HEPES 10mmol／L，MgCl21.06mmol／L，CaCl22mmol／L，TEA 136.9mmol／L，用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.4。1.3.6 瞬時外向鉀電流電極液 細(xì)胞內(nèi)液：KCl 150mmol／L，MgCl21.0mmol／L，EGTA 5.0mmol／L，ATP－K23.0mmol／L，HEPES 5.0mmol／L，用KOH調(diào)節(jié)PH至7.3。細(xì)胞外液：臺氏液中加入BaCl20.2mmol／L，CdCl20.1mmol／L分別阻斷L型鈣電流（ICa－L）及內(nèi)向整流鉀電流（IK1）。

1.3.7 內(nèi)向整流鉀電流電極內(nèi)液 細(xì)胞內(nèi)液：MgCl21.0 mmol／L，KCl 150mmol／L，EGTA 5.0mmol／L，HEPES 5.0 mmol／L，ATP－K23.0mmol／L，4－AP 5.0mmol／L，ATP－Mg 1.0mmol／L，用KOH調(diào)節(jié)PH至7.3。細(xì)胞外液：臺氏液中加入0.5mmol／L CdCl2阻斷L型鈣電流（ICa－L）。

1.4 α－2（807－844）肽段合成及其抗體的制備和純化 NCX α－2（807－844）肽段（807algtsvpdtfaskvaatqdqyadasignvtgsnavnvf 844）由北京康維世紀(jì)生物科技有限公司合成，并與KLH載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)?？筃CXα－2（807－844）肽段抗體（簡稱抗α－2抗體）的制備和純化參照文獻(xiàn)［6］的方法。選用健康的新西蘭大耳白兔作為免疫對象，分3次用抗原溶液加等體積弗氏佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射主動免疫，各組均于第一次主動免疫免疫前1d和第2次加強(qiáng)免疫后第10天，每只兔子于耳緣靜脈取血0.5 mL～1mL，分離血清，用間接ELISA法檢測抗體效價。使用Protein A層析柱純化總IgG。

1.5 單個心室肌細(xì)胞的分離 取SD大鼠，10%烏拉坦麻醉后迅速取出心臟，放入4℃含氧無鈣臺氏液中修剪，修剪后經(jīng)主動脈用棉線將心臟固定在Langendorff裝置（恒壓灌注，灌注壓約為80cmH2O，整個灌流系統(tǒng)用恒溫水浴保持在37℃）下方的灌流管上，無鈣臺氏液灌流10min～12min，待流出液清亮后換為酶液灌流20min左右，通氧持續(xù)整個過程。心肌組織經(jīng)酶解變軟后，用眼科剪剪下置于KB液中后，繼續(xù)用眼科剪剪碎心肌組織，用吸管輕輕吹打以分散心室肌細(xì)胞，200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 離子通道全細(xì)胞電流記錄 將適量細(xì)胞懸液置于倒置顯微鏡上的細(xì)胞灌流槽中，靜置3min～5min，待細(xì)胞充分貼壁后，以含鈣臺氏液灌流使細(xì)胞復(fù)鈣。微電極用電極拉制儀拉制，充灌電極內(nèi)液后，電極電阻2MΩ～5MΩ。選取貼壁良好、靜止、橫紋清晰、折光性好的細(xì)胞進(jìn)行封接。將電極緩緩移動至細(xì)胞表面，施以負(fù)壓使電極尖端和細(xì)胞膜之間產(chǎn)生高阻封接，補(bǔ)償電極電容，采用繼續(xù)施加負(fù)壓法破膜，進(jìn)行膜電容補(bǔ)償和串聯(lián)電阻補(bǔ)償后，形成穩(wěn)定的全細(xì)胞狀態(tài)，使用膜片鉗放大器和PCLAMP 9.0程序記錄膜電流。電流信號由Digidata 1322A模數(shù)轉(zhuǎn)換器（Axon Instruments，USA）、Axonpatch 200B膜片鉗放大器（Axon Instruments，USA）及Pclamp9.0（Axon Instruments，USA）采集、貯存及分析。在全細(xì)胞記錄狀態(tài)下維持電位為－40mV，給予從＋60mV到－120mV的斜坡電壓刺激，用5.0mmol／L的NiCl2特異性地阻斷Na＋／Ca2＋交換電流，NiCl2阻斷前后的電流差即為Ni2＋敏感Na＋／Ca2＋交換電流。在全細(xì)胞記錄狀態(tài)下維持電位為－40mV，刺激電壓持續(xù)200ms，緩慢去極化到0mV，記錄到一個緩慢失活的內(nèi)向電流，即為L型鈣通道電流。測定瞬時外向鉀電流時，維持電壓－40mV，給予階躍脈沖至＋50mV，持續(xù)1000ms激活I(lǐng)to。記錄內(nèi)向整流鉀電流時，維持電壓－40mV，去極化至－100mV，持續(xù)500ms的階躍脈沖激活I(lǐng)K1。

2 結(jié) 果

2.1 抗體效價、濃度及純化結(jié)果 間接ELISA法檢測結(jié)果表明，在第3次加強(qiáng)免疫后，抗心肌Na＋／Ca2＋交換α－2抗血清效價為1∶243 000。抗血清經(jīng)Protein A純化后，經(jīng)檢測抗α－2抗體濃度為7.21mg／mL。SDS－PAGE檢測顯示，純化后的抗體在電泳時出現(xiàn)清晰的2條帶，其分子量為25kD和50kD左右。詳見圖1。

圖1 α－2純化抗體的SDS－PAGE檢測

2.2 α－2抗體對大鼠心肌細(xì)胞Na＋／Ca2＋交換電流的作用 1 nmol／L～104nmol／L的α－2抗體對成年大鼠心肌細(xì)胞Na＋／Ca2＋交換電流呈劑量依賴性的抑制作用，在鉗制電位＋50 mV、－100mV時，Na＋／Ca2＋交換外向電流由分別下降（P＜0.05或P＜0.01）。詳見表1。

表1 α－2抗體對大鼠心肌細(xì)胞Na＋／Ca2＋交換電流的作用（ ±s）

表1 α－2抗體對大鼠心肌細(xì)胞Na＋／Ca2＋交換電流的作用（ ±s）

?

2.3 α－2抗體對大鼠心肌細(xì)胞L型鈣電流（ICa－L）的作用 ɑ－2抗體對L型鈣電流也具有抑制作用。在1nmol／L～104nmol／L濃度范圍內(nèi)，α－2抗體可使L型鈣電流分別分別下降（P＜0.01）。詳見表2。

表2 α－2抗體對大鼠心肌細(xì)胞L型鈣電流的作用（ ±s）

表2 α－2抗體對大鼠心肌細(xì)胞L型鈣電流的作用（ ±s）

?

2.4 α－2抗體對大鼠心肌細(xì)胞瞬時外向鉀電流（Ito）和內(nèi)向整流鉀通道電流（IK1）的影響 1nmol／L～104nmol／L的α－2抗體對大鼠心肌細(xì)胞瞬時外向鉀電流和內(nèi)向整流鉀電流均未見明顯影響。詳見圖2、圖3。

2.4 NCXα－2序列與L型鈣通道氨基酸序列比對及分析 通過對NCXα－2序列與形成L型鈣通道孔環(huán)的氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，NCXα－2（807－844）序列與L型鈣通道第2結(jié)構(gòu)域孔環(huán)（697～730位氨基酸）序列之間的相似性為23.7%。

3 討 論

本研究首次發(fā)現(xiàn)，在1nmol／L～103nmol／L時，抗心肌Na＋／Ca2＋交換體α－2（807－844）肽段抗體可特異性抑制大鼠心肌Na＋／Ca2＋交換電流，對L型鈣電流（ICa）、瞬時外向鉀電流（Ito）和內(nèi)向整流鉀電流（Ik1）則均無影響，表明1nmol／L～103nmol／L抗α－2抗體可作為大鼠心肌Na＋／Ca2＋交換的特異性抑制性抗體，并有可能作為工具藥進(jìn)行NCX功能特性的研究。

大量研究表明，NCX還參與了心力衰竭、心律失常以及多種器官的缺血／再灌注損傷等病理生理過程。在對心力衰竭動物模型和臨床心力衰竭患者的研究中均發(fā)現(xiàn)，有心肌細(xì)胞Na＋／Ca2＋交換體表達(dá)及其功能的上調(diào)［7，8］。本研究表明，1 nmol／L～103nmol／Lα－2抗體對大鼠心肌細(xì)胞Na＋／Ca2＋交換電流表現(xiàn)為特異性的抑制效應(yīng)。鑒于心力衰竭時心功能降低和心律失常的發(fā)生均可能與Na＋／Ca2＋交換體功能上調(diào)有關(guān)，由此推測，通過抑制Na＋／Ca2＋交換體的功能，一方面，可以減少鈣外排，有利于改善心力衰竭心肌收縮功能；另一方面，還可以減小由Na＋／Ca2＋交換產(chǎn)生的內(nèi)向電流，從而有可能抑制延遲后除極及心律失常的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，高濃度（104nmol／L）α－2抗體除抑制大鼠心肌Na＋／Ca2＋交換外，對L型鈣電流（ICa－L）電流也具有抑制作用。為解釋抗α－2抗體對L型鈣通道的交叉反應(yīng)，將NCXα－2序列與L－型鈣通道形成孔環(huán)的氨基酸序列進(jìn)行了比對。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，α－2（807－844）肽段與組成L－型鈣通道結(jié)構(gòu)域Ⅱ的孔環(huán)（鈣通道α亞基第697～730位氨基酸殘基）［9，10］之間具有23.7%的序列相似性。推測，NCXα－2肽段與L－型鈣通道孔環(huán)序列之間的相似性可能是α－2抗體對L型鈣電流（ICa－L）產(chǎn)生交叉免疫作用的基礎(chǔ)。

在1nmol／L～103nmol／L濃度范圍內(nèi)，α－2抗體對大鼠心肌細(xì)胞Na＋／Ca2＋交換電流表現(xiàn)為特異性的抑制效應(yīng)；對大鼠心肌細(xì)胞瞬時外向鉀電流和內(nèi)向整流鉀電流均無明顯影響。本研究為進(jìn)行NCX功能特性的研究提供了一種可用的抑制性工具藥，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)觀察α－2抗體對心力衰竭及缺血再灌注損傷的干預(yù)奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Blaustein MP，Lederer WJ.Sodium／calcium exchange：Its physiological implications［J］.Physiol Rev，1999，79（3）：763－854.

［2］ Reuter H，Pott C，Goldhaber JI，et al.Na＋－Ca2＋exchange in the regulation of cardiac excitation－contraction coupling［J］.Cardiovasc Res，2005，67（2）：198－207.

［3］ Munch G，Rosport K，Baumgartner C，et al.Functional alterations after cardiac sodium－calcium exchanger overexpression in heart failure［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，291（2）：H488－H495.

［4］ Marshall CR，F(xiàn)ox JA，Butland SL，et al.Phylogeny of Na＋／Ca2＋exchanger（NCX）genes from genomic data identifies new gene duplications and a new family member in fish species［J］.Physiological Genomics，2005，21（2）：161－173.

［5］ Shu X，Huang J，Dong Y，et al.Na，K－ATPase alpha2and Ncx4a regulate zebrafish left－right patterning［J］.Development，2007，134（10）：1921－1930.

［6］ 封啟龍，吳博威.抗鈉－鈣交換體α－1和α－2重復(fù)序列抗體的制備和純化［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，36（4）：395－398.

［7］ Grantham CJ，Cannell MB.Ca2＋influx during the cardiac action potential in guinea pig ventricular myocytes［J］.Circ Res，1996，79（2）：194－200.

［8］ Su Z，Zou A，Nonaka A，et al.Influence of prior Na＋pump activity on pump and Na＋／Ca2＋exchange currents in mouse ventricular myocytes［J］.Am J Physiol，1998，275（5Pt 2）：H1808－H1817.

［9］ Mikami A，Imoto K，Tanabe T，et al.Primary structure and functional expression of the cardiac dihydropyridine－sensitive calcium channel［J］.Nature，1989，340（6230）：230－233.

［10］ Nakai J，Adams BA，Imoto K，et al.Critical roles of the S3segment and S3－S4linker of repeat I in activation of L－type calcium channels［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91（3）：1014－1022.