桃小食心蟲病原菌—球孢白僵菌TST05菌株生物學特性研究

熊 琦， 朱永敏， 曹天文， 李 捷，薛皎亮＊， 謝映平， 王全亮， 杜仙當

（1．山西大學生命科學學院，太原 030006； 2．山西省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，太原 030032；3．山西省襄汾縣農(nóng)業(yè)局，襄汾 041500； 4．山西省稷山縣林業(yè)局，稷山 043200）

桃小食心蟲（Car posina sasakii Matsu mura）又名桃蛀果蛾，簡稱桃小。在日本、韓國和我國北方果園普遍發(fā)生，是危害嚴重的果樹食心蟲類害蟲。它的食性很雜，可為害蘋果、棗、梨、桃、杏、山楂等10多種果樹的果實［1］。該蟲以幼蟲鉆蛀果實內(nèi)部，使果實畸形，并在孔道和果核周圍殘留大量蟲糞，使果實喪失商品價值，給果農(nóng)造成很大的經(jīng)濟損失。以往主要使用化學殺蟲劑對其進行防治［2－4］，但易產(chǎn)生農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境、傷害天敵昆蟲等問題，推行生物防治技術(shù)是發(fā)展的趨勢。目前桃小食心蟲生物防治技術(shù)主要包括利用性誘劑、昆蟲天敵和病原微生物。球孢白僵菌［Beauveria bassiana（Bals．）Vuill．］是一類廣譜性昆蟲病原真菌，能防治多種農(nóng)林害蟲，如松毛蟲、天牛、玉米螟、小菜蛾、食心蟲等等［5－7］。并且球孢白僵菌對溫血動物和植物無害、易培養(yǎng)，被認為是最具開發(fā)潛力和應(yīng)用價值的蟲生真菌之一［8］。我國的白僵菌生產(chǎn)和防治松毛蟲的應(yīng)用是世界上最大的真菌殺蟲劑應(yīng)用項目，每年應(yīng)用面積50萬h m2左右，在持續(xù)控制害蟲和維持物種多樣性方面發(fā)揮了重要的作用［9］。只是不同來源的菌株生物學特性及致病力存在一些差異，其致病力主要取決于菌株、害蟲蟲態(tài)以及環(huán)境條件等多種因素。而菌株產(chǎn)孢量的高低、孢子萌發(fā)的快慢與多少等與毒力有很大的相關(guān)性［10］，外界溫度、濕度則是影響其毒力的2個最重要的環(huán)境因子［11－13］。因此，研究菌株的生物學特性，即培養(yǎng)條件和環(huán)境條件對其的影響，對應(yīng)用該菌株進行生物防治具有重要意義。本試驗選擇了一株分離自自然罹病桃小食心蟲幼蟲并對其具有較高致病力的球孢白僵菌TST05菌株，研究了不同培養(yǎng)基、溫度、濕度條件對菌落生長、產(chǎn)孢量以及孢子萌發(fā)的影響，為開發(fā)和應(yīng)用該菌株作為桃小食心蟲的生物防治菌種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 球孢白僵菌TST05菌株及其孢子懸浮液

球孢白僵菌TST05菌株，為本實驗室2009年從采自山西省襄汾縣蘋果園自然罹病的桃小越冬幼蟲上分離并鑒定（該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏中心，編號為CGMCC 4526）。將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)了7 d后的TST05菌株孢子用0．1%吐溫－80無菌水溶液洗下，用血球計數(shù)板計數(shù)后，制備成濃度為1×106孢子／mL的孢子懸浮液。

1．2 不同培養(yǎng)條件對TST05菌株菌落生長和產(chǎn)孢量的影響

1．2．1 培養(yǎng)基

選用5種培養(yǎng)基，分別是Cazpek、PDA、PPDA、SDAY、SMAY。各培養(yǎng)基的配方組成見表1。

表1 培養(yǎng)基的配方組成

吸取制備好的孢子懸浮液5μL分別滴加到Cazpek、PDA、PPDA、SMAY、SDAY平板培養(yǎng)基的中央。待懸浮液被吸收后，將培養(yǎng)皿移至（25±1．5）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個處理設(shè)5個重復(fù)，每隔1 d用十字交叉法測量1次菌落直徑，共測定14 d。同時觀察不同培養(yǎng)基上菌落生長狀況。培養(yǎng)40 h后，在體視顯微鏡下觀察菌落生長狀況，確定最初產(chǎn)孢時間。培養(yǎng)14 d后，用直徑為5 mm的打孔器在距離培養(yǎng)皿中心相同的位置取菌塊，放入小燒杯中，加0．1% 吐溫－80的水溶液20 mL，經(jīng)磁力攪拌器攪拌均勻后，用血球計數(shù)板測定孢子數(shù)，計算產(chǎn)孢量。

1．2．2 溫度

吸取孢子懸浮液5μL，接種到PDA培養(yǎng)基中部。將培養(yǎng)皿分別放置于15、20、25、30、35℃（±1．5℃）的人工氣候箱（SPX－250I－C型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)。相對濕度均設(shè)為100%±10%）中避光培養(yǎng)。每處理重復(fù)5皿，菌落直徑和產(chǎn)孢量測定同1．2．1。

1．2．3 濕度

將制備好的培養(yǎng)基分別在相對濕度為30%、50%、70%、80%、90%、100%（±10%）溫度均設(shè)為（25±1．5）℃的人工氣候箱中預(yù)先放置2 d后，吸取孢子懸浮液5μL接種到培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)皿分別置于不同濕度的人工氣候箱中避光培養(yǎng)。每處理重復(fù)5皿，菌落直徑和產(chǎn)孢量測定方法同1．2．1。

1．3 不同溫濕度對TST05菌株孢子萌發(fā)的影響

取20μL配好的孢子懸浮營養(yǎng)液（含有0．5%蛋白胨、2% 葡萄糖、0．1%K H2PO4和0．1% 吐溫－80），涂在無菌的潔凈載玻片上。風干后，將載玻片放于滅菌的培養(yǎng)皿中，置于不同溫濕度的人工氣候箱中進行培養(yǎng)。

1．3．1 溫度

將上述裝有載玻片的培養(yǎng)皿分別放置于15、20、25、30、35℃（±1．5℃）的人工氣候箱（相對濕度均設(shè)為100%±10%）中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后鏡檢統(tǒng)計孢子萌發(fā)情況。試驗中的每個處理均設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)檢查5個視野，每個視野不少于100個孢子。

1．3．2 濕度

將上述裝有載玻片的培養(yǎng)皿分別放置于30%、50%、70%、80%、90%、100%（±10%）的人工氣候箱（溫度均設(shè)為25±1．5℃）中培養(yǎng)。檢測方法同1．3．1。

1．4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件對不同處理組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，再以Duncan法對各處理之間進行方差分析和差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果

2．1 不同培養(yǎng)條件對TST05菌株菌落生長和產(chǎn)孢量的影響

2．1．1 不同培養(yǎng)基的影響

試驗結(jié)果（表2）顯示，TST05菌株在Cazpek培養(yǎng)基上菌落生長速度最慢，菌落直徑為3．82 c m，初始產(chǎn)孢時間為70 h，產(chǎn)孢量只有2．41×107孢子／mL，顯著低于其他4種培養(yǎng)基。而在PDA、PPDA、SDAY、SMAY 4種培養(yǎng)基上，TST05菌株的生長情況及產(chǎn)孢量沒有顯著差異，菌落生長與時間呈較好的線性關(guān)系，R2＞0．99。而且試驗中也觀察到在這4種培養(yǎng)基上生長的菌落厚而致密，孢子非常密集。其中在PDA培養(yǎng)基上的菌落直徑雖然不是最大，但是初始產(chǎn)孢時間卻較早，產(chǎn)孢量也較多，達到4．50×107孢子／mL。綜合考慮成本等因素，以下試驗選用PDA培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基上TST05菌株菌落生長及產(chǎn)孢情況1）

2．1．2 不同溫度的影響

如表3所示，TST05菌株的生長適應(yīng)溫度范圍較寬。在低溫15℃和高溫35℃條件下都能生長和產(chǎn)孢，雖然菌落直徑、產(chǎn)孢量顯著小于在20～30℃時生長的菌落，但產(chǎn)孢量仍達到了1．32×107孢子／mL以上。在20～30℃時都能達到很好的生長和較高的產(chǎn)孢量，菌落生長與時間呈較好的線性關(guān)系，其中25℃時斜率最大，表明生長速度最快。在25℃培養(yǎng)時營養(yǎng)生長量最大，菌落直徑為4．94 c m，產(chǎn)孢量也最多，達到6．19×107孢子／mL，顯著高于20℃和30℃。

表3 不同溫度下TST05菌株生長與產(chǎn)孢情況1）

2．1．3 不同濕度的影響

如表4所示，TST05菌株生長和產(chǎn)孢所需的濕度范圍也較寬。25℃時，當相對濕度降到30%時，雖然菌落生長較慢，菌落直徑為2．81 c m，但產(chǎn)孢量也能達到1．37×107孢子／mL。隨著濕度的加大，TST05菌株的菌落直徑、生長速度和產(chǎn)孢量都有顯著的增加。相對濕度為80%時，菌落直徑達到3．58 c m，產(chǎn)孢量為3．75×107孢子／mL。當相對濕度達到100%時，TST05菌株的菌落直徑最大、生長速度最快、產(chǎn)孢量也最多，顯著高于其他各組。

表4 不同濕度下TST05菌株生長與產(chǎn)孢情況

2．2 不同溫濕度對孢子萌發(fā)的影響

2．2．1 不同溫度的影響

從試驗結(jié)果（圖1）可看出，相對濕度100%時，TST05菌株的孢子在15～35℃條件下都能萌發(fā)。但是溫度的高低對孢子萌發(fā)有顯著影響。15℃時的萌發(fā)率為52．28%，萌發(fā)率隨著溫度的升高逐漸增加。25℃的萌發(fā)率最高，可達到98．49%，顯著高于其他溫度下孢子萌發(fā)率。隨著溫度的進一步升高，萌發(fā)率開始下降。30℃時降到75．23%，35℃時為29．82%，顯著低于其他試驗溫度。由此可見25℃是TST05菌株孢子萌發(fā)的最適溫度。此菌株孢子耐受低溫15℃的能力好于耐受高溫35℃的能力。

圖1 不同溫度對TST05菌株孢子萌發(fā)的影響

2．2．2 不同濕度的影響

由圖2可看出，25℃時，孢子在30%～100%的相對濕度范圍內(nèi)均能萌發(fā)，萌發(fā)率隨濕度的降低而降低。相對濕度在80%以上時，孢子萌發(fā)率能達到90%以上。相對濕度70%時萌發(fā)率降為76．43%，50%時孢子萌發(fā)率為63．95%。30%時，孢子萌發(fā)率為32．12%。因此，TST05菌株孢子萌發(fā)的適宜相對濕度在80%以上，最適濕度為100%。

圖2 不同濕度對TST05菌株孢子萌發(fā)的影響

3 討論

桃小食心蟲是蛀果害蟲，整個幼蟲生長期都在果實內(nèi)部，難以用傳統(tǒng)的農(nóng)藥噴施方法進行防治。在其生活史中，老熟幼蟲于9－10月從果實中鉆出，在樹干周圍1 m以內(nèi)的表土層中結(jié)冬繭越冬，到第2年4－5月，幼蟲破繭出土。一些學者［3－4］已探索在地面土層施藥對桃小食心蟲越冬幼蟲進行防治。所以，可通過在土中噴施菌液或拌施菌粉劑的方法，使桃小食心蟲越冬幼蟲在出入土時體表沾染病菌，發(fā)生感染，達到防治的目的。

本試驗結(jié)果表明該菌株易于培養(yǎng)，營養(yǎng)需求不高，適應(yīng)性較強。在營養(yǎng)較貧乏的PDA培養(yǎng)基上也能很好地生長，不論是營養(yǎng)生長還是產(chǎn)孢量都與在PPDA、SDAY、SMAY培養(yǎng)基上相仿。這有利于生產(chǎn)應(yīng)用時降低生產(chǎn)成本。其次不同溫濕度試驗結(jié)果表明該菌株適宜生長的溫濕度范圍較寬，在相對濕度100%、20～30℃時，或在最適宜的25℃、相對濕度大于80%時，都能得到很好的生長和較高的產(chǎn)孢量。同時在低溫15℃、高溫35℃、低濕度條件下也能較好的生長和產(chǎn)孢，說明該菌株對溫濕度的適應(yīng)性較強，施用后能在田間不同溫濕度下宿存，達到持續(xù)控制害蟲的作用。另外作為昆蟲的病原真菌，孢子的萌發(fā)及入侵是感染寄主的首要條件［7，14－15］。TST05菌株的孢子在較寬的溫濕度范圍內(nèi)都能萌發(fā)。在最適溫度25℃時，即使相對濕度降到30%，孢子萌發(fā)率也能達到32．12%。較低溫度對孢子萌發(fā)影響不大，15℃時孢子萌發(fā)率能達到52．28%。高溫對該菌株孢子的萌發(fā)影響較大。35℃時，相對濕度100%時孢子萌發(fā)率為29．82%。以往的研究報道桃小食心蟲幼蟲出土也需要一定的濕度，趙興敏［16］調(diào)查報告顯示，濕度變化對桃小食心蟲的發(fā)生影響十分明顯，當空氣濕度升高時，蟲口發(fā)生數(shù)量增加。花蕾等［17］研究表明，在室內(nèi)適宜濕度條件下（維持花盆內(nèi)5 c m處土溫在23～25℃，土壤含水量在13%左右），來自不同寄主桃小食心蟲越冬幼蟲均有一明顯的出土高峰。所以促使桃小幼蟲出土的濕度也有利于孢子的萌發(fā)。同時我們可以利用自然環(huán)境中的短期高濕條件，例如雨前噴施菌劑，或結(jié)合果園管理人為創(chuàng)造短期的高濕條件，在施用菌制劑后進行灌溉，保持土壤的短時濕潤，就能使足夠的孢子得以萌發(fā)，達到侵染寄主，提高防治效果的目的。鑒于TST05菌株在低溫和低濕條件下能保持較好的生長和孢子萌發(fā)，我們認為，該菌株能適應(yīng)干旱低溫條件，可開發(fā)應(yīng)用為防治桃小食心蟲的生物制劑。

［1］ 劉玉升，程家安，牟吉元．桃小食心蟲的研究概況［J］．山東農(nóng)業(yè)大學學報，1997，28（2）：207－214．

［2］ 劉長海，屈志成，閻錫海，等．陜北棗樹桃小食心蟲防治技術(shù)［J］．植物保護，2002，28（4）：32－33．

［3］ 李定旭．桃小食心蟲地面防治技術(shù)的研究［J］．植物保護，2002，28（3）：18－20．

［4］ 區(qū)中美．土壤撒施辛硫磷防治蘋果桃小食心蟲［J］．植物保護，1981，7（6）：19．

［5］ 陶訓，馮建國，莊乾營，等．白僵菌防治桃小食心蟲的研究［J］．山東農(nóng)業(yè)科學，1994（5）：39－42．

［6］ Sel man B J，Dayer S，Hasan M．Pat hogenicity of Beauveria bassiana （Bals．）Vuill to the lar vae of diamond back mot h，Pl utell a xylostell a［J］．Jour nal of Applied Ento mology，1997，121（1）：47－49．

［7］ 田志來，阮長春，李啟云，等．球孢白僵菌對昆蟲致病機理的研究進展［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（36）：16000－16002．

［8］ Feng M G，Poprawski T J，Khachatourians G G．Pr oduction for mulation and application of the ento mopat hogenic f ungus Beauveria bassiana for insect control：current stat us［J］．Biocontrol Science and Technology，1994，4：3－34．

［9］ 宋漳．白僵菌分生孢子深層培養(yǎng)及其對馬尾松毛蟲的毒力［J］．應(yīng)用與環(huán)境生物學報，2005，11（1）：93－97．

［10］王成樹，王四寶，李增智．球孢白僵菌高毒菌株篩選模型的研究［J］．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，1998，6（3）：245－249．

［11］王寶輝，鄭建偉，黃大莊，等．綠僵菌MS01菌株的生物學特性及在不同溫濕度下對光肩星天牛幼蟲的致病力［J］．林業(yè)科學，2009，45（9）：158－162．

［12］Inglis G D，Johnson D L，Goettel M S．Effects of te mperature and sunlighton mycosis（Beauveria bassiana）of grasshoppers under field condition［J］．Envir on Ento mol，1997，26：89－97．

［13］季香云，楊長舉．白僵菌的致病性與應(yīng)用［J］．中國生物防治，2003，19（2）：82－85．

［14］Talaei－h(huán)assanloui R，Kharazi－pakdel A，Goettel M S，et al．Ger mination polarity of Beauveria bassiana conidia and its possible correlation with vir ulence［J］．Jour nal of Invertebrate Pat hology，2007，94：102－107．

［15］Hajek A E，Eastburn C C．Attach ment and ger mination of Ento mophaga mai maiga conidia on host and non－h(huán)ost lar val cuticle［J］．Jour nal of Invertebrate Pat hology，2003，82：12－22．

［16］趙興敏．溫濕度的變化對桃小食心蟲的影響［J］．河北林業(yè)科技，2002（6）：21－22．

［17］花蕾，馬谷芳．不同寄主桃小越冬幼蟲的出土規(guī)律［J］．昆蟲知識，1993，30（1）：22－25．