Tn5及其應(yīng)用研究進(jìn)展

徐廣宇，魏成國，馬金姝，張曉天，王 放＊

（1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，吉林 長春 130021；2.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013）

轉(zhuǎn)座子是基因組中一段可移動的DNA序列，可以通過切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個位置“跳躍”到另一個位置［1］。Barbara Mc－Clintock［2，3］根據(jù)大量遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果，于1951年提出了生物的基因組中存在轉(zhuǎn)座子學(xué)說，這是遺傳學(xué)發(fā)展史中劃時代的重大發(fā)現(xiàn)，將基因概念向前推進(jìn)了一大步。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及基因功能研究的不斷深入，轉(zhuǎn)座子技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛。Transposon 5（Tn5）由于其轉(zhuǎn)座的隨機(jī)性好、穩(wěn)定性高、插入位點(diǎn)容易測序等特點(diǎn)，得到越來越多的應(yīng)用，已經(jīng)成為分子遺傳學(xué)及基因診斷學(xué)研究的熱門工具［4，5］。本文主要對Tn5的基本結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)座機(jī)制及其在必需基因、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能、基因測序方面的應(yīng)用研究進(jìn)展作一綜述。

1 Tn5簡介

1.1 Tn5的基本結(jié)構(gòu)

Tn5是復(fù)合轉(zhuǎn)座子，由一個中心區(qū)域和二個側(cè)翼序列組成。中心區(qū)域含有3個抗生素抗性基因，包括卡那霉素（kanamycin）、鏈霉素（streptomycin）和博萊霉素（bleomycin），中心區(qū)域的兩側(cè)的側(cè)翼序列IS是一種自主性的轉(zhuǎn)座因子。位于Tn5右側(cè)的IS50R編碼含有476個氨基酸的轉(zhuǎn)座酶（transposase，tnp）和一個轉(zhuǎn)座阻遏蛋白（inhibitor protein，Inh），這兩種蛋白質(zhì)都由同一段DNA序列編碼；Tn5左側(cè)的IS50L與右側(cè)的IS50R只是一對堿基的差別，IS50L上存在一個突變序列，可以使翻譯提前終止，不能產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座阻遏蛋白［6］。每個IS50轉(zhuǎn)座元件的兩端有長度19 bp的outside end（OE）和inside end（IE）末端序列，OE是轉(zhuǎn)座酶的結(jié)合位點(diǎn)（圖1）。

1.2 Tn5的轉(zhuǎn)座機(jī)制

1.2.1 Tn5的轉(zhuǎn)座過程 Tn5的轉(zhuǎn)座屬于非復(fù)制型轉(zhuǎn)座。在轉(zhuǎn)座過程中，Tn5轉(zhuǎn)座酶單體先綁定到Tn5末端OE上的結(jié)合位點(diǎn)，并且連接供體DNA形成復(fù)合體；形成聯(lián)會復(fù)合體后，在某種條件下（熱刺激或者陽離子存在）Tn5轉(zhuǎn)座酶具有切割DNA的活性，使Tn5從復(fù)合物中釋放；離開復(fù)合體后Tn5隨機(jī)插入到目的DNA上，插入位點(diǎn)的9 bp序列的兩條鏈會分開，并分別連接在Tn5的兩端形成粘性末端（圖2）；最后在DNA聚合酶的作用下補(bǔ)平缺口，轉(zhuǎn)座子的兩端形成9 bp 的正向重復(fù)序列［6，7］。

圖1 Tn5的基本結(jié)構(gòu)

圖2 Tn5插入位點(diǎn)的復(fù)制

1.2.2 Tn5轉(zhuǎn)座位點(diǎn)的確認(rèn) Tn5轉(zhuǎn)座元件IS50的末端有一段長19bp的序列，我們跟據(jù)此序列設(shè)計(jì)特定引物，然后使用反向PCR法對Tn5插入位點(diǎn)的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增（圖3），測序后通過BLAST系統(tǒng)就可以得到Tn5插入基因的序列［8］。

圖3 Tn5插入位點(diǎn)的確定

2 Tn5的應(yīng)用研究進(jìn)展

2.1 Tn5在必需基因方面的研究進(jìn)展

維持某種生物細(xì)胞生長所必需的基因被稱為是這個生物的必需基因［9］。轉(zhuǎn)座子可以對基因進(jìn)行調(diào)控，是因?yàn)檗D(zhuǎn)座子插入后會引起插入位點(diǎn)所在基因失活。如果插入的基因是必需基因，則該細(xì)菌死亡，不能生成菌落；如果插入的是非必需基因，則可能影響該基因的表達(dá)，但不影響該細(xì)菌的生長，生成菌落，因此我們可以通過轉(zhuǎn)座子篩選出非必需基因。

由于Tn5的轉(zhuǎn)座隨機(jī)性更高，穩(wěn)定性更好，并且插入位點(diǎn)更容易確認(rèn)，因而發(fā)現(xiàn)必需基因的幾率更高，更準(zhǔn)確。S.Y.Gerdes［10］等通過Tn5構(gòu)建的遺傳印記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌MG1655的遺傳物質(zhì)中存在大量轉(zhuǎn)座進(jìn)化形成的REP序列，在4291個蛋白編碼基因中，篩選出3746個基因，其中包括620個必需基因和3126個非必需基因。Byung Jo Yu和Sun Chang Kim［11］等在大腸桿菌中通過Tn5構(gòu)建的Cre／loxP重組系統(tǒng)，利用Tn5高效隨機(jī)插入和卡那霉素抗性基因產(chǎn)生的突變菌庫，篩選出大量的非必需基因，進(jìn)而找到篩選必需基因的可行性。Severine［12］等在豬布魯士菌中使用Tn5建立相關(guān)鼠科模型，通過研究發(fā)現(xiàn)norD基因不僅編碼與豬布魯士菌毒性密切相關(guān)的一氧化氮還原酶，而且也是豬布魯士菌的必需基因。

我們可以通過Tn5對一些病原體必需基因的研究，開發(fā)潛在的藥物作用靶點(diǎn)，更加有效地治療疾?。?3，14］。肺炎克雷伯菌是一個眾所周知的條件致病菌，在呼吸道感染的早期階段可能與其生物膜的形成有關(guān)，Heather F［15］等通過mini－Tn5突變體庫的構(gòu)建，研究了在體外生物膜形成和體內(nèi)肺炎克雷伯菌感染之間的關(guān)系，并且找到相關(guān)的基因；Stahlhut SG［16，17］等通過Tn5產(chǎn)生的隨機(jī)突變，分離肺炎克雷伯菌臨床株C3091的生物膜基因并構(gòu)建克隆質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)，共篩選出1152個能增強(qiáng)生物膜特性的克隆體，其中9個克隆體能顯著增強(qiáng)生物膜的特性，5個克隆體包含眾所周知的與肺炎克雷伯菌毒力因子和生物膜相關(guān)的類型3鞭毛基因。

我們還可以通過對某些病原體必需基因的鑒定，而使其成為診斷該疾病的標(biāo)準(zhǔn)。Sakamoto H［18］等在原核病原生物瘧原蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，很多轉(zhuǎn)座子在瘧原蟲中轉(zhuǎn)座效率很低，而從大腸桿菌中分離并重新構(gòu)建的Tn5的衍生物mini－Tn5具有很高的轉(zhuǎn)座效率，因此通過構(gòu)建mini－Tn5轉(zhuǎn)座穿梭突變，建立了通過必需基因診斷瘧原蟲病的方法。

2.2 Tn5在蛋白質(zhì)方面的研究進(jìn)展

近年來，隨著分子生物學(xué)及轉(zhuǎn)座子技術(shù)的廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)座子逐漸成為蛋白質(zhì)功能研究的重要工具。通過轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)插入，可以找到相關(guān)功能的開放閱讀框架，進(jìn)而影響相關(guān)的基因表達(dá)，即對蛋白質(zhì)功能進(jìn)行研究［19］。

Tn5在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能方面的研究主要體現(xiàn)在通過Tn5的高效隨機(jī)插入，由Tn5上攜帶的已知基因和未知目的基因產(chǎn)生融合蛋白，因?yàn)殡S機(jī)插入的目的基因不同，產(chǎn)生的融合蛋白也不相同，通過對不同融合蛋白的研究就能發(fā)現(xiàn)相關(guān)的目的基因以及相應(yīng)的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。兔熱病桿菌是一種能感染人類淋巴系統(tǒng)的病原體，為了對這個病原體進(jìn)行遺傳分析，Blake W.［20］等建立了一個溫度敏感的以Tn5為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，通過活躍的轉(zhuǎn)座酶的催化作用，找到能夠產(chǎn)生與LacZ基因或luxCDABE基因相關(guān)的染色體報(bào)告融合蛋白，并能夠監(jiān)測基因表達(dá)的能力，從而建立了兔熱病桿菌毒力相關(guān)基因的一個新的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。James A.［21］等通過Tn5構(gòu)建了的輔助基因轉(zhuǎn)座子插入技術(shù)（Transposon Assis ted Gene Insertion Technology，TAGIT），通過輔助基因轉(zhuǎn)座子插入技術(shù)把綠色熒光蛋白基因（green fluorescent protein，GFP）隨機(jī)插入到染色體位點(diǎn)上，但不破壞其操縱子結(jié)構(gòu)，然后對綠色熒光蛋白進(jìn)行追蹤分析，最終有可以得到有用的部分功能的靶蛋白。

Tn5在蛋白質(zhì)功能方面研究的應(yīng)用還通過其衍生物Tnpho A進(jìn)行［22，23］。當(dāng) Tn－pho A 隨機(jī)插入目 的 DNA 時，有缺陷的pho A的羧基端肽段可能融合到目的蛋白的氨基端肽段上，并在目的基因和pho A之間產(chǎn)生正確的閱讀框架，結(jié)果可產(chǎn)生融合蛋白。Tn－pho A在研究蛋白方面有許多應(yīng)用：1.檢測蛋白的表達(dá)并定位蛋白；2.通過隨機(jī)插入目的DNA，找到新的編碼跨膜蛋白或細(xì)胞周間質(zhì)蛋白的基因。在研究原核生物病原體特定輸出信號中，Matthew［24］等通過構(gòu)建mini－Tn5 pho A方法在輸出蛋白和pho A基因中產(chǎn)生融合蛋白，以此來分離特殊輸出信號，并且由實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，結(jié)核分支桿菌4種分泌蛋白能夠攜帶敏感信號Tat，因此表明Tat是重要的與人類疾病相關(guān)的致病因素。

2.3 Tn5在基因測序的應(yīng)用

基因測序，即測定DNA序列。目前用于測序的技術(shù)主要有Sanger等（1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和 Maxam和Gilbert（1977）發(fā)明的化學(xué)降解法。這兩種方法不僅測序的時間長，而且過程繁瑣。1994年Sootte等利用構(gòu)建人工轉(zhuǎn)座子，在原有測序技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了一種快速簡便的DNA的測序方法。Tn5在基因測序方面的應(yīng)用是最近的研究熱點(diǎn)，Tn5的插入是一個隨機(jī)性很高的過程，當(dāng)Tn5轉(zhuǎn)座后，先利用攜帶的抗性基因進(jìn)行陽性篩選，然后使用轉(zhuǎn)座子兩端的特異序列構(gòu)建引物，通過引物對陽性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行測序，最后通過計(jì)算機(jī)對擴(kuò)增的序列進(jìn)行分析，進(jìn)而得到完整的序列信息。用Tn5轉(zhuǎn)座子進(jìn)行測序不僅快速，而且準(zhǔn)確。

一般轉(zhuǎn)座子對目標(biāo)DNA插入是有一定位點(diǎn)的選擇性，但Tn5對于目標(biāo)DNA的插入選擇基本完全隨機(jī)，因此其在基因測序方面的應(yīng)用非常廣泛。Tn5轉(zhuǎn)座子用于測序有以下幾個優(yōu)點(diǎn)：（1）形成大量的轉(zhuǎn)座突變體，可以同時測序，使測序更快捷便利；（2）可以在Tn5上加入一些修飾基因，使測序更方便。

3 展望

隨著遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)座子技術(shù)的應(yīng)用也越來越廣泛。Tn5由于其隨機(jī)性好，轉(zhuǎn)座后穩(wěn)定，轉(zhuǎn)座頻率高，易于篩選等一系列優(yōu)點(diǎn)，成為了研究基因、蛋白質(zhì)功能和測序的有效工具，并且在疾病診斷、基因治療、免疫功能研究等方面顯示了良好的前景。但Tn5也有一些不足，如雖然Tn5的轉(zhuǎn)座隨機(jī)性很高，但仍有一些熱點(diǎn)冷點(diǎn)存在；Tn5轉(zhuǎn)座酶活性的高低影響了Tn5的轉(zhuǎn)座效率等。此外，Tn5在微生物、植物、動物乃至人類的基因功能研究中都發(fā)揮著重要的作用，隨著研究的深入，Tn5的應(yīng)用也會更廣泛，人們對基因功能的認(rèn)識也將會更加全面。

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