雙抗體夾心ELISA檢測(cè)人胎兒血紅蛋白體系的建立

李雪麗，文李艷，馮善偉，鐘 梅，劉艷君＊，富 寧

（1.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫教研室，廣東 廣州 510515；2.廣州市人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所，廣東 廣州 510410；3.南方醫(yī)科大學(xué) 南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515）

胎兒血紅蛋白（Fetal Hemoglobin，Hb F）由2條α鏈和2條γ鏈組成，出生時(shí)約占血紅蛋白總量的70%，然后快速減少，6－12個(gè)月后濃度小于2%，到成年時(shí)降至血紅蛋白總量的1%以下。在許多血液系統(tǒng)疾病尤其是β地中海貧血的篩查中，檢測(cè)Hb F是一項(xiàng)不可或缺的指標(biāo)［1］。在某些惡性腫瘤中，Hb F可作為腫瘤標(biāo)記物預(yù)示腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2］。在產(chǎn)科疾病中，檢測(cè)HbF可以快速判定胎兒向母體出血等疾?。?］。目前檢測(cè)Hb F多采用蛋白質(zhì)電泳、抗酸染色和堿變性法，這些方法靈敏度比較低，而靈敏度和準(zhǔn)確度較高的高效液相色譜法價(jià)格昂貴，不適合大規(guī)模篩查［4］。本研究利用自制的抗人Hb F單克隆抗體和兔抗人Hb F多克隆抗體，建立了HbF的單多抗夾心ELISA檢測(cè)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 抗人HbF單抗2C8、多抗均由本室自制［5］，HRP－羊抗兔IgG為北京鼎國(guó)生物公司產(chǎn)品；BSA購(gòu)自廣州斯佳生物技術(shù)公司。自行配制以下試劑：紅細(xì)胞裂解液（Tris－NH4Cl）包被液系0.05 M 碳酸鹽緩沖液（CB，p H9.6）、ELISA 封閉液（5%脫脂奶粉，用洗液配制）、洗液（50m MTris，0.14 M NaCl，0.1%Tween－20，p H8.0）、樣品稀釋液（50 m M Tris，0.14 M NaCl，1%BSA，0.05%Tween－20，p H8.0）、TMB底物液（臨用前 A、B液等體積混勻）、2M H2SO4終止液均自行配制。

1.1.2 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀Perkin Elmer wallac1420；自動(dòng)洗板機(jī)購(gòu)自美國(guó)BIO－RAD公司；37℃數(shù)顯三用恒溫水浴箱，購(gòu)自金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.1.3 血液樣本 臍帶血取自南方醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，標(biāo)準(zhǔn)品為本實(shí)驗(yàn)室工作人員的全血標(biāo)本；100份血標(biāo)本取自廣州市人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所，以上標(biāo)本均用高效液相色譜法測(cè)定其 含量，于－70℃保存。

1.2 方法

1.2.1 樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的制備 用本室工作人員的全血標(biāo)本作為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)該份標(biāo)本用高效液相色譜法測(cè)定Hb F的含量（百分比），五分類血球儀測(cè)定總血紅蛋白（Hb），分裝并保存于－20℃。取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)血樣品，加入9倍體積的Tris－NH4Cl裂解，37℃水浴30 min，加入10×樣品稀釋液，8 000 rpm離心5 min，取裂解液上清用樣品稀釋液稀釋一定的比例。

1.2.2 檢測(cè)HbF雙抗體夾心ELISA方法的建立用0.05 M CB（p H 9.6）稀釋捕獲抗體2C8至10 μg／ml，每孔100μl包被，4℃過夜；次日洗液洗滌3遍后，每孔加入5%脫脂奶粉封閉液300μl，37℃2 h；洗滌5遍后，每孔加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品，于37℃孵育30 min；洗滌5遍后，加入兔抗人Hb F多抗10μg／ml，100μl／孔，37℃30 min；洗滌5遍后每孔加入100μl HRP－羊抗兔IgG（1∶5000），37℃30 min；充分洗滌后加入TMB底物液，常規(guī)顯色，2MH2SO4終止反應(yīng)，以波長(zhǎng)450 nm測(cè)定OD值。以Hb F濃度作為自變量，OD450作為應(yīng)變量，進(jìn)行曲線擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 100份血標(biāo)本的檢測(cè) 用自行建立的Hb F檢測(cè)體系測(cè)定100份全血標(biāo)本的HbF濃度，每份血標(biāo)本設(shè)立雙復(fù)孔測(cè)定。結(jié)果用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定 經(jīng)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品Hb為137 g／L，Hb F含量為1%。將其裂解后分別稀釋為24.66、4.932、0.986、0.197、0.039μg／ml，作為本檢測(cè)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的五個(gè)測(cè)定點(diǎn)。

2.2 確定捕獲抗體2C8的最佳工作濃度 在檢測(cè)抗體濃度為5μg／ml時(shí)，用不同濃度的2C8抗體包被，進(jìn)行夾心ELISA檢測(cè)臍血中Hb F的濃度。結(jié)果如圖1，當(dāng)單抗的包被濃度為10μg／ml時(shí)，ELISA測(cè)定的吸光度值最高，因此，單抗的包被濃度選擇為10μg／ml。

2.3 確定檢測(cè)抗體的最佳工作濃度 在單抗包被濃度為10μg／ml的條件下，用不同濃度的兔抗Hb F多抗檢測(cè)臍血中Hb F的濃度，比較其檢測(cè)效果。結(jié)果如圖2，當(dāng)多抗?jié)舛葹?0μg／ml，吸光度值較高且與15μg／ml效果相仿，因此，檢測(cè)抗體的濃度選擇為10μg／ml。

圖1 抗HbF單抗2C8不同包被濃度的檢測(cè)效果比較

圖2 兔抗HbF多抗不同濃度檢測(cè)效果的比較

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 標(biāo)準(zhǔn)品裂解后稀釋至相應(yīng)濃度，進(jìn)行ELISA測(cè)定。通過抗原濃度的自然對(duì)數(shù)Ln（X）與OD450值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。結(jié)果如圖3，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Y＝0.1017Ln（X）＋0.5472，r2＝0.9986.線性范圍在0.039－24.66μg／m之間，能夠滿足臨床血標(biāo)本檢測(cè)的需要。

圖3 HbF濃度的自然對(duì)數(shù)Ln（X）與OD450值關(guān)系圖

2.5 可重復(fù)性測(cè)定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可重復(fù)性 分別比較6次實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線Y軸90%、50%、10%各點(diǎn)所代表的Hb F濃度，其變異系數(shù)見表1。結(jié)果可見，3個(gè)OD450點(diǎn)所代表的濃度值的變異系數(shù)均小于15%，說明標(biāo)準(zhǔn)曲線的可重復(fù)性較好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可重復(fù)性測(cè)定（n＝6）

2.5.2 批內(nèi)、批間差異測(cè)定 取3份含不同Hb F濃度的全血標(biāo)本，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)測(cè)定，每次實(shí)驗(yàn)每種濃度進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定（每次測(cè)定設(shè)立2復(fù)孔，取其平均值為一個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，即每種濃度同時(shí)做12孔），反復(fù)進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算批間批內(nèi)變異系數(shù)，結(jié)果見表2、3。本體系批內(nèi)平均變異系數(shù)6.6%，批間平均變異系數(shù)6.4%，說明本檢測(cè)體系的可重復(fù)性好。

表2 HbF檢測(cè)實(shí)驗(yàn)批內(nèi)可重復(fù)性測(cè)定（n＝6）

表3 HbF檢測(cè)實(shí)驗(yàn)批間可重復(fù)性測(cè)定（n＝6）

2.6 100份血標(biāo)本的HbF含量檢測(cè)結(jié)果 100份血標(biāo)本的ELISA結(jié)果與高效液相色譜法結(jié)果比較如表4，以HbF占總血紅蛋白的1%作為臨界值，ELISA結(jié)果與高效液相色譜法符合率為89%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩種檢驗(yàn)方法之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2＝0.216，P＞0.05）。

表4 100份血標(biāo)本測(cè)定的卡方檢驗(yàn)表格

3 討論

本研究利用自行制備的抗人HbF單抗和多抗成功地建立了人Hb F檢測(cè)體系。在前期單抗的制備和鑒定中，我們用ELISA、Western blot證明了包被抗體2C8只與Hb F發(fā)生特異性結(jié)合，與其他兩種血紅蛋白（Hb A、Hb A2）無(wú)交叉反應(yīng)［5］，本體系采用單抗作為捕獲抗體，保證了檢測(cè)的特異性。在包被單抗已特異地捕獲抗原的基礎(chǔ)上，多抗與抗原結(jié)合的位點(diǎn)和機(jī)會(huì)都大于單抗，因此，以多抗作為檢測(cè)抗體，又能保證檢測(cè)的靈敏度［6］。由于血標(biāo)本中Hb F的含量并不會(huì)很低，因此本體系更偏重于考慮標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系和檢測(cè)的特異性，同時(shí)，略低的靈敏度也可避免樣品稀釋倍數(shù)過高而造成的誤差和不便。本研究結(jié)果顯示，Hb F的檢測(cè)靈敏度為0.039μg／ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合系數(shù)達(dá)到0.9986，線性關(guān)系好，批內(nèi)變異系數(shù)小于10%，批間變異系數(shù)小于15%，重復(fù)性較好。

Hb F的γ鏈有兩種類型：Gγ和Aγ，二者的差別僅為一個(gè)氨基酸不同，Gγ136位為甘氨酸，Aγ為丙氨酸。胎兒出生時(shí)Hb F含量為總血紅蛋白的80%，Gγ占 Hb F的比例為70%，Aγ占30%［7］。至兒童和成人，Gγ占Hb F的比例下降至40－60%。本科室制備的抗Hb F抗體，是用臍血免疫的，前期工作中嘗試過以臍血作為標(biāo)準(zhǔn)品，但由于臍血中兩種γ鏈比例與成人不同［8］，臍血與正常人血檢測(cè)結(jié)果存在一定差異。因預(yù)期臨床樣本均來(lái)自兒童或成人，為使標(biāo)準(zhǔn)品與檢測(cè)標(biāo)本一致，我們選擇正常人全血標(biāo)本作為標(biāo)準(zhǔn)品。在檢測(cè)Hb F的方法中，高效液相色譜法的準(zhǔn)確性最高［4］，因此，標(biāo)準(zhǔn)品的定值采用的是高效液相色譜法。在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)血液標(biāo)本的凍融次數(shù)對(duì)于紅細(xì)胞裂解有一定影響。為保證結(jié)果的一致性，標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)標(biāo)本的凍融次數(shù)盡量一致，而在裂解之后加入10×樣品緩沖液，既能終止Tris－NH4Cl的裂解，又可使各個(gè)濃度梯度的樣品處于相同的緩沖條件中。

應(yīng)用自行建立的ELISA檢測(cè)了100份血標(biāo)本，所測(cè)值與高效液相色譜法的結(jié)果比較，以HbF 1%作為臨界值，發(fā)現(xiàn)兩種方法的符合率約為89%，雖然比較兩種方法測(cè)定的絕對(duì)值，符合率只有40%，但這種差異對(duì)于臨床以1%為臨界值判斷Hb F的病理水平并無(wú)影響，因此，本ELISA方法可在一定程度上代替高效液相色譜法，更廣譜、低廉地應(yīng)用于臨床和基礎(chǔ)研究。

Hb F在許多血液系統(tǒng)疾病中都表現(xiàn)為升高，包括地中海貧血、鐮刀型細(xì)胞貧血、遺傳性Hb F持續(xù)增多癥、骨髓異常增生等疾病［9］。而早在上世紀(jì)七十年代人們就開始注意到惡性腫瘤Hb F表達(dá)量的增加，現(xiàn)已證明許多惡性腫瘤尤其是胚胎惡性腫瘤，血液系統(tǒng)腫瘤和大腸癌，其 表達(dá)量呈明顯增加［10］。因此，Hb F的定量檢測(cè)對(duì)于這些疾病的診斷和預(yù)防發(fā)揮著越來(lái)越大的作用。目前，國(guó)外商品化試劑盒多采用雙多抗夾心ELISA，特異性稍差，且為進(jìn)口試劑盒，價(jià)格昂貴［4］。本實(shí)驗(yàn)所建立的單多抗ELISA檢測(cè)體系特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，有望應(yīng)用于以后的臨床檢測(cè)和基礎(chǔ)研究。

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