和厚樸酚脂質(zhì)體聯(lián)合阿霉素抑制4T1細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

張 宇，白海昕，邵永祥，郭慶章，黃 鑫，王 迪，邢立舉，翟秀偉

（大慶龍南醫(yī)院 神經(jīng)外科，黑龍江 大慶 163453）

和厚樸酚（honokiol）是從傳統(tǒng)中藥厚樸的根皮、枝皮中提取分離的一種帶有烯丙基的聯(lián)苯二酚類化合物，是厚樸的主要有效成分之一，分子式為C18H18O2。近年研究表明其具有良好的抗腫瘤活性，可以抑制腫瘤新生血管形成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等作用，其抗腫瘤效應(yīng)具有多靶點、多效應(yīng)、毒副作用低的特點，在抗腫瘤治療中受到了越來越多的關(guān)注［1－3］。

因此我們設(shè)想和厚樸酚與低劑量常規(guī)化療藥物聯(lián)合可能具有協(xié)同抗腫瘤作用，同時可以降低常規(guī)化療藥物的毒副作用。鑒于和厚樸酚在水中溶解度很小，且易氧化，傳統(tǒng)方法是用二甲亞砜溶解，但二甲亞砜本身具有一定毒性，限制了其臨床應(yīng)用。為提高和厚樸酚的溶解性和穩(wěn)定性，本實驗選擇了脂質(zhì)體來包裹和厚樸酚。

1 材料與方法

1.1 材料

和厚樸酚購自成都思科華生物技術(shù)公司，卵磷脂、膽固醇購自成都科龍化工試劑廠，PEG－PE購自天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，阿霉素、MTT購自Sigma公司，DMEM、胎牛血清等購自Gibco BRL公司?？筩yclin D1多克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 空白脂質(zhì)體的制備 采用薄膜－超聲分散法制備。精密稱取磷脂／膽固醇／PEG－PE（1∶0.3∶0.08，mol／mol／mol），加入氯仿和甲醇（1∶4，v／v）使其溶解，減壓蒸發(fā)成薄膜，加入一定量的超純水使薄膜脫落溶解，超聲震蕩，即得空白脂質(zhì)體的混懸液。再將混懸液冷凍干燥成粉便于保存。

1.2.2 和厚樸酚脂質(zhì)體的制備 采用薄膜－超聲分散法制備。精密稱取磷脂／膽固醇／PEG－PE（1∶0.3∶0.08，mol／mol／mol），和厚樸酚／總脂類（1∶4，w／w）。加入氯仿和甲醇（1∶4，v／v）使其溶解，減壓蒸發(fā)成薄膜，加入一定量的超純水使薄膜脫落溶解，超聲震蕩1 h，即得和厚樸酚脂質(zhì)體的混懸液。再將混懸液冷凍干燥成粉便于保存。

1.2.3 脂質(zhì)體粒徑大小的測定 取適量脂質(zhì)體用超純水稀釋后，用激光粒度儀檢測樣品的平均粒徑。

1.2.4 脂質(zhì)體包封率的測定 藥物的包封率是指被包裹在脂質(zhì)體囊中的藥物占脂質(zhì)體混懸液中藥物總量的比例。本實驗采用魚精蛋白絮凝－離心法分離游離藥物與脂質(zhì)體。脂質(zhì)體懸液2 000 r／min離心10分鐘，沉淀未包封的析晶出來的游離藥物，用移液槍精密吸取上層0.1 ml脂質(zhì)體懸液于1 ml EP管中，加入0.1 ml 10 mg／ml魚精蛋白溶液，渦旋2 min，靜置3 min，在室溫條件下離心40 min（13 000 r／min），沉淀脂質(zhì)體，吸掉上清液，將沉淀用氮氣吹干，加入1 ml乙腈超聲破乳，離心（12 000 r／min，5 min）。取上清液，流動相稀釋后用HPLC法測定峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算包封于脂質(zhì)體中的藥物量。

其中W總為藥物總量，W游為游離藥物量。

1.2.5 細(xì)胞系及培養(yǎng) 小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞，由本實驗室保存，用含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素、100μg／ml鏈霉素的DMEM 完全培養(yǎng)基、5%CO2、37℃培養(yǎng)。

1.2.6 細(xì)胞增殖試驗（MTT法） 參照文獻(xiàn)［4］用完全培養(yǎng)液調(diào)整4T1細(xì)胞濃度為2×104／ml，接種于96孔板，每孔200μl，培養(yǎng)過夜，次日分別用不同濃度和厚樸酚脂質(zhì)體、阿霉素、以及和厚樸酚與阿霉素聯(lián)合處理細(xì)胞，對照組不處理，每個劑量組設(shè)5個復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)1、2、3、4 d后，取1個培養(yǎng)板，每孔加入5 mg／ml MTT試劑20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2－4 h，再加DMSO 150μl，振蕩混勻15 min，用酶標(biāo)儀（λ＝570 nm）測定吸光度（A）值（A值與活細(xì)胞數(shù)成正比），取其平均值。相對細(xì)胞增殖率（%）＝實驗組A570／對照組A 570×100%。實驗至少重復(fù)3次。

協(xié)同指數(shù)（the combination index，CI）的計算公式是：CI＝（D1／Dx1）＋（D2／Dx2），Dx1指單純和厚樸酚脂質(zhì)體對細(xì)胞抑制率為x%時所需劑量；D1指與阿霉素（劑量為D2）聯(lián)合對細(xì)胞抑制率也為x%時所需劑量。Dx2指單純阿霉素對細(xì)胞抑制率為x%時所需劑量；D2指與和厚樸酚脂質(zhì)體（劑量為D1）聯(lián)合對細(xì)胞抑制率也為x%時所需阿霉素的劑量。CI＜1.0，兩者之間關(guān)系為拮抗；CI＝1.0，疊加；CI＞1.0，協(xié)同［5］。

1.2.7 流式細(xì)胞儀分析 取對數(shù)生長期的4T1細(xì)胞，按每孔1×105個細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入和厚樸酚脂質(zhì)體，使其終濃度分別為10 μg／ml、12μg／ml和14μg／ml，并設(shè)不加和厚樸酚脂質(zhì)體的對照組，培養(yǎng)24 h。收集不同處理組和對照組的細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入70%冷乙醇固定細(xì)胞，4℃過夜。離心之后加入含RNase的PI染料，半小時后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.8 免疫蛋白印記 （Western blot） 分組（同上），細(xì)胞加藥后12 h，提取細(xì)胞總蛋白，用Biorad法進(jìn)行定量，取20μg蛋白進(jìn)行10%SDS－PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，TBST洗3次，室溫加入1∶200兔多克隆抗cyclin D1（1∶1000）孵育2 h，TBST洗膜3次，加入1∶5 000稀釋的羊抗兔IgG／AP，室溫孵育2 h，TBST洗膜，顯色。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS11.0軟件進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計的單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的粒徑和包封率

馬爾文粒度儀檢測得到，空白脂質(zhì)體的平均粒徑為64.7 nm，和厚樸酚脂質(zhì)體的平均粒徑為96.3 nm，粒徑分布范圍窄且符合正態(tài)分布規(guī)律。

取三批不同時間制備的和厚樸酚脂質(zhì)體測定含量分別為：2.984 mg／ml、1.292 mg／ml、1.587 mg／ml，離心后測得游離的和厚樸酚濃度為0.453 mg／ml、0.192 mg／ml、0.196 mg／ml，由公式計算得到平均包封率為84.75%。

2.2 和厚樸酚和阿霉素對4T1細(xì)胞生長的抑制作用

由圖1A、1B的MTT檢測結(jié)果顯示，空白脂質(zhì)體組對4T1細(xì)胞增殖的影響與陰性對照相比沒有明顯差異。和厚樸酚脂質(zhì)體和阿霉素處理細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為17.65±0.32μg／ml和0.78±0.08μg／ml。但阿霉素與10μg／ml，12μg／ml和14μg／ml和厚樸酚脂質(zhì)體聯(lián)合處理細(xì)胞后，阿霉素的IC50分別下降了0.5倍、3倍、15倍（P＜0.05）。由圖1C可見兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同指數(shù)CI＜1，呈協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)和厚樸酚脂質(zhì)體濃度為14μg／ml，阿霉素濃度為0.2μg／ml時，CI值最低。結(jié)果表明低劑量的阿霉素與和厚樸酚脂質(zhì)體聯(lián)合有協(xié)同抑制4T1細(xì)胞增殖的作用。

圖1 和厚樸酚脂質(zhì)體與阿霉素聯(lián)合對4T1細(xì)胞增殖的影響

2.3 流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期

由表1可見，10μg／ml，12μg／ml and14μg／ml和厚樸酚脂質(zhì)體處理4T1細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布時發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚脂質(zhì)體對4T1細(xì)胞周期分布的影響不只是減少S期細(xì)胞比例，還可將細(xì)胞周期阻滯在G0／G1期，從而降低細(xì)胞分裂增殖指數(shù)。

2.4 Western blot檢測周期蛋白表達(dá)

由圖2可見，對照組細(xì)胞與阿霉素處理組細(xì)胞Cyclin D1免疫反應(yīng)信號表達(dá)較強(qiáng)，和厚樸酚脂質(zhì)體處理組信號表達(dá)下降，且隨濃度增加，信號強(qiáng)度逐漸減弱，聯(lián)合處理組的信號強(qiáng)度最弱。

表1 和厚樸酚脂質(zhì)體對4T1細(xì)胞周期的影響 （n＝3）

圖2 和厚樸酚脂質(zhì)體對4T1細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強(qiáng)，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。在臨床上被廣泛地應(yīng)用于乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌、急性淋巴細(xì)胞白血病及粒細(xì)胞白血病等的治療，主要的毒性反應(yīng)有：白細(xì)胞和血小板減少，約60%－80%的病人可發(fā)生；100%的病人有不同程度的毛發(fā)脫落，停藥后可以恢復(fù)生長；心臟毒性，表現(xiàn)為心律失常，ST－T改變，多出現(xiàn)在停藥后的1－6個月；惡心、食欲減退；藥物溢出血管外可引起組織潰瘍及壞死。另外，用藥后尿液可出現(xiàn)紅色［6］。

和厚樸酚是從厚樸的根皮、枝皮中提取分離的一種帶有烯丙基的聯(lián)苯二酚類化合物，是厚樸的有效成分之一。研究表明和厚樸酚在體外具有抗新生血管和抗腫瘤的作用，并在體內(nèi)具有抑制血管肉瘤的作用，且未觀察到明顯的毒副作用［1－3］。因此我們選用和厚樸酚脂質(zhì)體和阿霉素聯(lián)合使用，觀察其能否起到協(xié)同抗腫瘤作用并且通過降低阿霉素的劑量而減輕其化療毒副作用。

本實驗研究結(jié)果顯示，在體外和厚樸酚脂質(zhì)體聯(lián)合低劑量阿霉素有協(xié)同抗乳腺癌的作用，從而降低了阿霉素的使用劑量，產(chǎn)生協(xié)同作用可能的作用機(jī)制有以下幾個方面：

聯(lián)合增強(qiáng)了針對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

本研究結(jié)果顯示，和厚樸酚聯(lián)合阿霉素可以顯著抑制4T1細(xì)胞生長與增殖，并呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)（CI＜1），和厚樸酚脂質(zhì)體濃度為14μg／ml，阿霉素濃度為0.2μg／ml時，協(xié)同效應(yīng)最明顯。

聯(lián)合增強(qiáng)了細(xì)胞周期調(diào)控和誘導(dǎo)凋亡

細(xì)胞周期（cell cycle）是指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。

我們對實驗中的兩種藥物的協(xié)同作用機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)10 g／ml、12 g／ml和14 μg／ml和厚樸酚脂質(zhì)體處理4T1細(xì)胞24h后，隨著和厚樸酚脂質(zhì)體濃度的增加，S期細(xì)胞數(shù)明顯降低，大部分細(xì)胞被阻滯在G0／G1期，這說明和厚樸酚在抑制細(xì)胞增殖的同時，可降低細(xì)胞周期中S期細(xì)胞的比例，使細(xì)胞停滯在G0／G1期，減少分裂期細(xì)胞比例。而阿霉素屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用，因此兩者聯(lián)合使用增強(qiáng)了抗腫瘤作用。

同時本實驗中用 Western blot檢測了12μg／ml和14μg／ml和厚樸酚脂質(zhì)體、0.2μg／ml阿霉素以及12μg／ml和厚樸酚脂質(zhì)體與0.2μg／ml阿霉素聯(lián)合處理細(xì)胞后cyclin D1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示隨著和厚樸酚脂質(zhì)體濃度增加，cyclin D1的表達(dá)有所減少，而聯(lián)合處理組cyclin D1的表達(dá)明顯降低。而已有研究表明cyclin D1的過表達(dá)將使細(xì)胞周期素依賴激酶4（CDK4）對Rb的調(diào)節(jié)失常，細(xì)胞周期G1／S期轉(zhuǎn)換時間縮短，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程使細(xì)胞呈現(xiàn)無限增殖，導(dǎo)致癌變［7］。所以我們的實驗進(jìn)一步驗證了兩者協(xié)同作用可能的分子機(jī)制。

綜上所述，本實驗采用傳統(tǒng)中藥中提取的和厚樸酚與細(xì)胞毒類化療藥物阿霉素聯(lián)合使用，體外實驗結(jié)果顯示具有顯著的協(xié)同效應(yīng)，降低了阿霉素的用量，從而減輕了其可能的毒副作用，對進(jìn)一步探索乳腺癌的聯(lián)合治療具有一定的意義。

［1］Fong WF，Tse AK，Poon KH，Wang C.Magnolol and honokiol enhance HL－60 human leukemia cell differentiation induced by 1，25－dihydroxyvitamin D3 and retinoic acid［J］.Int J Biochem Cell Biol，2005，37：427.

［2］Konoshima T，Kozuka M，Tokuda H，Nihsino H，Iwashima A，Haruna M，Ito K，Tanabe M.Studies on inhibitors of skin tumor promotion，IX：neolignans from Magnolia officinalis［J］.J Nat Prod，1991，54：816.

［3］Wang T，Chen F，Chen Z，Wu YF，Xu XL，Zheng S，Hu X.Honokiol induces apoptosis through p53－independent pathway in human colorectal cell line RKO［J］.World J Gastroenterol，2004，10：2205.

［4］James C，William GD，Adi FG，et al.Evaluation of a tetrazoliunr based semiautomated colorimetric assay：assessme of chemosensitivity testing［J］.Cancer Res，1987，15：936.

［5］Chou TC，Talalay P.Quantitative analysis of dose－effect relationship：the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors［J］.Adv Enzyme Regul，1984，22：27.

［6］孫 燕，石遠(yuǎn)凱.臨床腫瘤內(nèi)科手冊［M］.第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007.

［7］McDonalld ER，EI－Deiry WS.Cell cycle control as a basis for cancer drug development［J］.Int J Oncol，2000，16：871.