肥胖大鼠尿蛋白排泄增加及意義

杜 娟，魏立晶

（1.長(zhǎng)春市中心醫(yī)院 腎內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130051；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科）

肥胖是由于能量攝入超過(guò)消耗，導(dǎo)致體內(nèi)脂肪積聚過(guò)多而造成的疾病。1997年世界衛(wèi)生組織（WHO）明確宣布肥胖為一種疾病。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和文明程度的提高，人們的飲食習(xí)慣和生活方式也在逐漸的改變，肥胖的發(fā)生率越來(lái)越高。

1974年Weisinger等首次報(bào)道嚴(yán)重肥胖患者出現(xiàn)大量蛋白尿并命名為肥胖相關(guān)性腎病 （ORG）。以后有個(gè)案報(bào)告、尸檢資料及臨床病理資料均證實(shí)肥胖可引起腎臟損害。在我們以前的臨床觀察中也發(fā)現(xiàn)，肥胖可以導(dǎo)致蛋白尿的增加［1，2］。但其發(fā)病機(jī)制目前仍不十分清楚。

本研究采用高營(yíng)養(yǎng)飲食誘導(dǎo)大鼠制成肥胖動(dòng)物模型，檢測(cè)尿蛋白的排泄，并探討蛋白尿的變化及意義。

1 研究方法

1.1 肥胖動(dòng)物模型的建立［3］

選擇體重60－100 g之間的健康 Wistar大鼠20只。雌雄不拘，分籠飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天。隨機(jī)分為：1）正常對(duì)照組（Con組）：8只；2）實(shí)驗(yàn)組（Ob組）：12只。Con組給予普通飼料，Ob組給予高營(yíng)養(yǎng)飲食。以上動(dòng)物和飼料均由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。Ob組與Con組在同一環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水。每周稱量體重（g），身長(zhǎng)（cm），尾長(zhǎng)一次（cm）。

1.2 留取標(biāo)本

在實(shí)驗(yàn)14周時(shí)，Ob組與Con組大鼠均置于代謝籠中，自由飲水，收集24小時(shí)全部尿液，稱取尿液體積（ml），取4 ml備檢測(cè)尿蛋白，視黃醇結(jié)合蛋白（RBP），尿肌酐。取大鼠左側(cè)腎臟，置于冰袋上，切取腎臟皮質(zhì)迅速放入2.5%戊二醛中固定，待做電鏡標(biāo)本。腎臟其余部分放入4%多聚甲醛中固定，待做光鏡標(biāo)本。

1.3 觀察指標(biāo)的測(cè)定

（1）計(jì)算 Lee’s指數(shù)，體重 （g）1／3×103／體長(zhǎng)（cm）。

（2）尿蛋白，RBP，尿肌酐由LX20型生化自動(dòng)分析儀（美國(guó)BACKMAN－COULTER公司）測(cè)定。

（3）血糖，血脂，血尿酸（UA），血肌酐（Cre），血尿素氮（BUN），胰島素由生化自動(dòng)分析儀測(cè)定。

（4）腎小球?yàn)V過(guò)率（GFR）用內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）表示，Ccr（ml／min）＝尿肌酐濃度（umol／L）／血肌酐濃度（umol／L）×24小時(shí)尿量（ml）／（60分×24）。

（5）常規(guī)制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色及 Masson染色，光鏡下觀察腎臟結(jié)構(gòu)。

（6）常規(guī)制備電鏡標(biāo)本，JEM－1200EX型透射電鏡下觀察，拍攝照片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 0周時(shí)Ob組與Con組比較性別、體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)，Lee’s指數(shù)等無(wú)差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2 14周時(shí)Ob組體重、身長(zhǎng)，Lee’s指數(shù)明顯高于Con組（p＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 Ob組與Con組大鼠基線參數(shù)比較

表2 14周時(shí)Ob組與Con組大鼠體重比較

2.3 Ob組與Con組在14周時(shí)比較尿量無(wú)明顯差異，RBP無(wú)明顯差異，Ob組在14周時(shí)尿蛋白明顯高于Con組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同時(shí)間Ob組與Con組大鼠尿蛋白比較

2.4 14周時(shí)Ob組Ccr明顯高于Con組（P＜0.01）。

2.5 14周時(shí)Ob組與Con組比較空腹血糖升高，高密度脂蛋白降低（P＜0.05）。Ob組個(gè)別大鼠的胰島素高達(dá)44.42IU／ml，但二組間比較無(wú)明顯差異。Ob組個(gè)別大鼠呈乳糜血，但二組間甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白無(wú)明顯差異。Ob組與Con組比較血尿酸（UA），血肌酐（Cre），血尿素氮（BUN）等無(wú)差異（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 14周時(shí)Ob組與Con組大鼠血生化指標(biāo)的比較

2.6 14周時(shí)Ob組與Con組光鏡下腎臟病理觀察結(jié)果：Con組大鼠腎臟為正常組織結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1和圖3。Ob組大鼠腎臟被膜光滑，腎小球在切片上呈圓形，鏡下見(jiàn)腎皮質(zhì)區(qū)腎小球肥大，腎小囊狹窄，節(jié)段性毛細(xì)血管閉塞，球囊粘連，見(jiàn)圖2和圖4。

2.7 14周時(shí)電鏡下腎臟皮質(zhì)觀察結(jié)果：Con組大鼠腎臟為正常腎小球結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖5。Ob組大鼠腎臟腎小球?yàn)V過(guò)膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮細(xì)胞呈固縮狀細(xì)胞核，核內(nèi)染色質(zhì)趨邊凝聚；基底膜輕度增厚，偶見(jiàn)雙軌征；足細(xì)胞呈粗大狀，核呈不規(guī)則形，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，可見(jiàn)次級(jí)溶酶體，還可見(jiàn)均質(zhì)狀圓形小體，足突輕度微絨毛化；系膜區(qū)基質(zhì)增生，系膜細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞核呈不規(guī)則型，核內(nèi)異染色質(zhì)趨邊凝聚；毛細(xì)血管腔內(nèi)可見(jiàn)大量紅細(xì)胞，見(jiàn)圖6。

3 討論

3.1 高熱量飲食誘導(dǎo)大鼠制成肥胖動(dòng)物模型

肥胖是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，鑒于臨床中大多數(shù)肥胖患者是由于高熱量飲食導(dǎo)致的，故本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)Wistar大鼠制成肥胖動(dòng)物模型。

幼年動(dòng)物對(duì)高脂食物更敏感，所以實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，選擇體重60－100 g之間的健康 Wistar大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和肥胖模型組，二組間的性別、體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)，Lee’s指數(shù)等均無(wú)差異。正常對(duì)照組給予普通飼料，每克含熱量12.4焦耳，而肥胖模型組給予高脂肪高熱量飼料，每克含熱量16.9焦耳。飼料中高比例的脂肪成分可能破壞了能量攝入的調(diào)節(jié)機(jī)制，引起所謂的“高脂性食欲亢進(jìn)”［4］。14周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，Ob組體重、身長(zhǎng)，Lee’s指數(shù)明顯高于Con組（P＜0.05）。Ob組出現(xiàn)血脂異常，其中高密度脂蛋白明顯低于Con組（P＜0.05），甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白與Con組比較雖無(wú)明顯升高，但亦有上升的趨勢(shì)。Ob組大鼠腹部脂肪較多，腎臟的大體標(biāo)本可見(jiàn)腎周脂肪組織較多，反映了局部脂肪組織的蓄積，因此認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型。

3.2 肥胖大鼠蛋白尿的排泄增加

本實(shí)驗(yàn)觀察了二組大鼠分別在14周的尿量變化。在不同的時(shí)間點(diǎn)二組大鼠的尿量無(wú)明顯變化，但Ob組有減少的趨勢(shì)，與既往報(bào)道相同［5］。

此外還觀察了二組大鼠分別在14周的尿蛋白變化。二組間比較RBP的變化亦不明顯，RBP可自由通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)膜，99.97%在近曲小管被重吸收，故正常情況下尿中含量甚微。當(dāng)腎小管受損傷時(shí)，RBP重吸收減少，尿中排泄增加，而從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，Ob組大鼠的腎小管損害并不嚴(yán)重。

14周時(shí)Ob組大鼠24小時(shí)尿蛋白定量明顯高于Con組，正常情況下，腎小球毛細(xì)血管濾過(guò)膜的電荷屏障與機(jī)械屏障共同阻擋了血漿中大分子蛋白的濾出，小分子蛋白可以通過(guò)毛細(xì)血管壁，但濾過(guò)量很小，在近曲小管被重吸收，遠(yuǎn)曲小管分泌蛋白可進(jìn)入尿液，但量很少，所以認(rèn)為尿蛋白的出現(xiàn)及升高是腎小球病理性改變的標(biāo)志。

3.3 肥胖大鼠腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變

本實(shí)驗(yàn)采用HE染色和MASSON染色等方法觀察了Ob大鼠腎臟病理結(jié)構(gòu)，光鏡下可見(jiàn)Ob組大鼠腎小球呈圓形，未見(jiàn)明顯增生和萎縮，毛細(xì)血管袢未見(jiàn)壞死，腎小球毛細(xì)血管未見(jiàn)擴(kuò)張充血，管壁未見(jiàn)增厚，腎小管上皮完好，間質(zhì)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，為基本正常腎臟結(jié)構(gòu)。與Con組比較無(wú)明顯區(qū)別。

本研究通過(guò)透射電子顯微鏡觀察Ob大鼠腎小球的結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明Ob組大鼠內(nèi)皮細(xì)胞呈固縮狀細(xì)胞核，核內(nèi)染色質(zhì)趨邊凝聚，有類似凋亡的改變；基底膜輕度增厚，偶見(jiàn)系膜細(xì)胞插入形成的雙軌征；足細(xì)胞呈粗大狀，核呈不規(guī)則形，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，可見(jiàn)次級(jí)溶酶體，還可見(jiàn)均質(zhì)狀圓形小體，足突輕度微絨毛化。

從電鏡結(jié)果來(lái)看，肥胖大鼠腎小球超微病理改變明顯，也為肥胖大鼠產(chǎn)生蛋白尿提供有力的形態(tài)學(xué)依據(jù)。國(guó)內(nèi)有學(xué)者用形態(tài)計(jì)量學(xué)的方法研究了腎病大鼠足細(xì)胞的形態(tài)變化規(guī)律，并同時(shí)觀察其與不同時(shí)間點(diǎn)尿蛋白排出量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞體積和形態(tài)的變化與尿蛋白排出量直接相關(guān)，而且足細(xì)胞的變化早于尿蛋白的變化［6］，該結(jié)論支持本研究結(jié)果。

3.4 肥胖導(dǎo)致蛋白尿的機(jī)制及意義

評(píng)價(jià)腎小球?yàn)V過(guò)功能最重要的參數(shù)是腎小球?yàn)V過(guò)率，即每分鐘經(jīng)腎小球?yàn)V出的血漿液體量。因其檢測(cè)方法較復(fù)雜，故采用內(nèi)生肌酐清除率代替。肌酐是肌酸的代謝產(chǎn)物，大部分從腎小球?yàn)V過(guò)，不被腎小管重吸收，排泌量很少。而血肌酐的生成量和尿肌酐的排出量較恒定，故每分鐘內(nèi)將若干毫升血液內(nèi)的內(nèi)生肌酐全部清除出去，即為內(nèi)生肌酐清除率。本研究結(jié)果顯示，Ob組大鼠Ccr明顯高于Con組，反映出Ob組大鼠GFR明顯升高。這正是腎功能早期改變的證據(jù)。而此時(shí)反映腎小球?yàn)V過(guò)功能的其他指標(biāo)包括尿素氮、血肌酐和血尿酸等尚無(wú)明顯改變。

目前認(rèn)為蛋白尿的發(fā)生與腎小球?yàn)V過(guò)屏障喪失正常的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，正常腎小球?yàn)V過(guò)膜包括三層結(jié)構(gòu)，從內(nèi)到外為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞層，基底膜和足細(xì)胞層。足細(xì)胞層是尿蛋白濾出的最后屏障，被稱為“細(xì)篩”，也是最容易受損的細(xì)胞成分。近年來(lái)人們研究證實(shí)了一系列位于足突裂孔隔膜或由足細(xì)胞表達(dá)的蛋白，這些蛋白在蛋白尿發(fā)生中的作用成為人們研究的熱點(diǎn)。

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