杏仁皮渣中維生素E的酶法輔助萃取工藝研究

賀小賢, 劉昌蒙

(陜西科技大學 生命科學與工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

維生素E(Vitamin E, VE)是人體內具有廣泛生理功能的天然抗氧化劑，它可以對抗自由基的破壞作用，降低不飽和脂肪酸的過度氧化，防止脂質過氧化物的形成[1].現(xiàn)代研究表明，維生素E能誘導調控包括TTP和CYP3A等在內的某些基因，在轉錄水平發(fā)揮調控作用, 還能參與某些信號轉導，從而實現(xiàn)抑制炎癥反應、細胞黏附等的功能[2].總之，維生素E對所有細胞的正常新陳代謝都有重要作用，在抗各種氧化損傷性疾病中具有安全性和實用性，在基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學領域以及公共科學等領域都引起了人們極大的興趣.

目前維生素E主要有：一是以富含VE的玉米油、麥胚芽等為原料進行有機浸提和蒸餾[3-6]，二是運用化學方法合成.天然維生素E主要通過第一種途徑獲得，但維生素E不易滲透穿過細胞膜和細胞壁，溶出率低，造成了有機浸提的困難.由于植物細胞壁主要成分是果膠質和纖維素，因此果膠酶可以有效破壞細胞壁,增加膜透性,從而促進VE從組織中釋放，但是此方面的研究還未見報道.杏仁中含有較豐富的維生素E，營養(yǎng)價值極高.目前主要是對杏仁油和杏仁蛋白的提取及性質進行研究,皮渣往往被當作廢物丟棄，造成了資源的浪費[7-9].本文以杏仁的皮渣下腳料為原材料，通過添加果膠酶研究不同酶添加量、酶解時間、溫度以及pH等因素對維生素E提取率的影響，并通過正交試驗獲得最佳的提取工藝，為充分合理的利用杏仁資源提供科學的實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

原料及處理：市售杏仁，購于西安市達仁堂藥店.收集杏仁皮渣，經(jīng)真空冷凍干燥后粉碎，低溫保存待用.

丙酮，無水乙醇(均為分析純);PC-3精制果膠酶(酶活力3萬U/g);維生素E標準品(DL-α-生育酚).

1.2 實驗儀器設備

DZF-1B型真空干燥箱；RE52CS-1旋轉蒸發(fā)器；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋；SHZ-III型循環(huán)水真空泵；電子天平；756PC型紫外分光光度計；GT10-1高速離心機.

1.3 實驗方法

提取工藝流程為：杏仁皮渣→真空干燥→粉碎→稱重→酶解→有機浸提→測吸光度值.

具體操作流程為：稱取一定量杏仁皮渣粉末，加入一定量的酶解液在一定條件下酶解若干時間，離心去上清后加入無水乙醇：丙酮(9∶1)的混合溶劑在60 ℃下水浴浸提120 min,連續(xù)提取2次，合并提取液后旋轉蒸發(fā)濃縮至干，用無水乙醇復溶，定容至10 mL,在最大吸收峰處測吸光度值.

1.3.1 紫外吸收光譜的確定和標準曲線的繪制

精密稱取維生素E標準品100 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇至刻度，振搖溶解，配制成濃度為10 mg/mL的溶液，吸取1 mL該溶液至100 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇至刻度，振搖溶解，以無水乙醇為空白對照，用紫外分光光度計作200～500 nm掃描,確定最大吸收峰.

以上述所得100μg/mL維生素E溶液為標準溶液，分別精密吸取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL置于6個10 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，以無水乙醇為空白對照，在292 nm處測定其吸光度.以維生素E濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，以濃度對吸光度進行回歸，計算回歸方程.

1.3.2 酶法輔助提取的單因素和正交試驗

主要考察果膠酶用量、料液比、酶解時間、溫度及pH等因素對維生素E提取效果的影響.酶用量分別為原料的0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%, 料液比(原料與水的質量體積比)依次為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，酶解時間依次為30、45、60、75、90 min, 酶解溫度依次為45、50、55、60、65 ℃，pH依次為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0.

確定果膠酶用量，以提取液的吸光度值為考察指標，選擇L9(34)正交試驗設計優(yōu)化酶解條件.每次吸取1 mL樣液，按照標準曲線的測定方法測定提取液的吸光度，并根據(jù)線性回歸方程計算VE的提取率，并以提取率為考察指標，確定最佳酶解條件.正交試驗因素水平設計如表1所示.

式中：M為杏仁皮渣粉末的質量, g;C為維生素E的濃度，mg/mL;n為稀釋倍數(shù),n=10.

表1 果膠酶提取VE正交試驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 維生素E標準曲線及回歸方程

將維生素E標準溶液經(jīng)紫外吸收光譜掃描后，確定最大吸收峰為292 nm, 線性回歸方程為：y=7.967 3x+0.005 8,R2=0.993.

2.2 料液比對維生素E提取效果的影響

料液比會影響酶解液的濃度和底物濃度，進而對酶促反應的速率產(chǎn)生影響，一定時間內反應速率越大則反應越完全，即維生素E越能獲得有效釋放.在酶用量0.5%，反應溫度50 ℃，pH 3.0的條件下，改變料液比依次為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35酶解60 min，考察不同料液比對提取效果的影響，結果如圖1所示.

由圖1可知，料液比不同，則維生素E的提取率也不同.料液比為1∶25時，提取率最大；當料液比超過1∶25時，所的提取率略有下降，所以最適宜的料液比應選擇1∶25.這可能是因為料液比較小，稀釋了果膠酶的濃度，減少了果膠酶與細胞壁中β-半乳糖醛酸的接觸機會使反應速率降低，破壁作用減弱；料液比過大時又可能造成細胞β-半乳糖醛酸與果膠酶接觸不完全，同樣會使提取效果變差.

圖1 不同料液比對提取效果的影響

2.3 果膠酶用量對維生素E提取效果的影響

果膠酶作為催化劑，它的用量會直接影響酶促反應的速率.因此要對果膠酶的用量進行考察.在料液比1∶25，反應溫度50 ℃，pH 3.0, 反應時間60 min的條件下，改變果膠酶的用量.不同酶用量對提取效果的影響如圖2所示.

圖2 不同酶用量對提取效果的影響

實驗結果表明不同酶用量條件下，提取液的吸光值存在差異.從圖中可以看出，一定范圍內，所用酶量越大，維生素E的得率越高，且在0.7%時達到最大即提取效果最好；當酶用量繼續(xù)增大時，提取率反而有所下降.這可能是因為在底物濃度一定的情況下，增加果膠酶的用量可以使細胞與酶充分接觸，反應完全；但當酶用量過大時，底物濃度相對較低，導致酶對細胞的作用減弱，故從節(jié)約成本和提高得率的角度考慮，酶用量以0.7%為宜.

2.4 pH對酶解提取效果的影響

酶的活性可以影響酶促反應的速率，而酶的活性受環(huán)境pH的影響極為明顯，通常酶只有在最適pH處才能表現(xiàn)最大活力，pH值過高或過低均會抑制其活性.所以考察pH對提取效果的影響是十分必要的.在酶用量0.7%，料液比1∶25，反應溫度50 ℃，反應時間為60 min的條件下，改變pH.圖3為不同pH對提取效果的影響.

圖3 不同pH對提取效果的影響

由圖中可以看出，pH值不同則提取液的吸光值不同.在pH 3.5時提取率最大，高于或低于3.5，提取率均有所下降.產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是果膠酶的活力受其所處環(huán)境pH的影響，在一定范圍內隨pH值的增大而增大，且在最適pH值處達到最大值；超過最適pH后酶活力又會下降.果膠酶的作用pH在2.5～6.0，最適pH在3.5左右，所以酶解的最佳pH選擇3.5.

2.5 酶解溫度對VE提取效果的影響

酶的催化作用受溫度的影響也很大，在最適溫度表現(xiàn)最大酶活，低于或高于此溫度都會使酶活力降低從而影響酶促反應的速率.在酶用量0.7%，料液比1∶25，反應時間為60 min，pH 3.5的條件下， 改變反應溫度.不同作用溫度對提取效果的影響如圖4所示.

圖4 不同酶解溫度對提取效果的影響

如圖所示，45～55 ℃范圍內，酶解溫度越高則提取效果越好,且在55 ℃時達到最佳，當溫度超過55 ℃后，維生素E提取率開始下降.原因是酶解過程中在一定范圍內升高溫度會提高酶活；但溫度過高時會使酶變性失活，酶的穩(wěn)定性下降對反應不利.果膠酶的最適溫度在15～55 ℃左右，故應該選擇的最佳酶解溫度是55 ℃.

2.6 酶解時間對VE提取效果的影響

隨著酶解時間的延長，底物濃度和產(chǎn)物濃度發(fā)生變化而對酶促反應產(chǎn)生影響.在酶用量0.7%,料液比1∶25，反應溫度55 ℃， pH 3.5的條件下，改變反應時間.不同作用時間對提取效果的影響如圖5所示.

圖5 不同酶解時間對提取效果的影響

從圖5可以看出，一定范圍內作用時間越長則維生素E提取效果越好，且在75 min時達到最大提取率，這可能是因為隨著反應時間的延長，果膠酶的活力得到充分利用，反應進行的較為完全；超過75 min以后值有所下降，可能是因為酶解時間過長，底物大量被消耗濃度降低同時產(chǎn)物濃度的增加也會抑制酶解過程，導致酶活性降低，使酶解效果變差.因此, 選擇75 min為最佳酶解時間.

2.7 果膠酶提取維生素E的最佳工藝

表2 果膠酶提取VE正交試驗結果

根據(jù)單因素的實驗結果，選擇L9(34)正交試驗設計優(yōu)化酶解條件，以維生素E的提取率為考察指標，所得結果如表2所示.

由表2正交試驗結果可知，各因素影響VE提取效果的順序依次為D﹥A﹥B﹥C, 即pH對提取效果的影響最大，料液比次之，然后是酶解時間和酶解溫度.果膠酶的添加量為0.7%，最優(yōu)組合是A2B3C2D2，由于該組合未出現(xiàn)在表2中，而表中最佳組合為A2B3C1D2，將兩者實驗結果進行比較得選擇A2B3C2D2組合時，提取液吸光值為0.417,則維生素E的提取率為10.32 mg/g>8.89 mg/g，故選擇的最佳酶解工藝組合為A2B3C2D2，即料液比1∶25，酶解溫度55 ℃，pH 3.5 , 水解75 min.這一結果與前面單因素篩選結果完全吻合.

3 結束語

果膠酶能夠有效水解杏仁皮渣的細胞壁，促進維生素E高效釋放而與溶劑直接接觸，改善提取效果.以杏仁皮渣為原料，拓寬了利用杏仁資源的途徑，通過單因素篩選確定果膠酶的添加量為0.7%，通過正交實驗優(yōu)化，確定了各因素對提取效果的影響順序依次為pH﹥料液比﹥酶解時間﹥酶解溫度；酶法輔助的最佳酶解工藝為料液比1∶25，pH 3.5, 溫度為55 ℃時水解75 min.此時，維生素E的提取率可達10.32 mg/g.

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