水溶性甲殼素-絲素復(fù)合膜的制備及生物相容性

張 敏， 許小玲， 孟曉榮

(1.陜西科技大學(xué) 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 710021； 2.西安建筑科技大學(xué) 理學(xué)院, 陜西 西安 710055)

0 引言

甲殼素、殼聚糖及其衍生物具有獨(dú)特的無毒、無害和抗菌性能，其生物相容性好，具有消炎，不過敏、能促進(jìn)傷口愈合等優(yōu)異的生物特性[1,2].目前，國內(nèi)外也已開發(fā)了甲殼質(zhì)類醫(yī)用敷料、醫(yī)用縫合纖維、婦嬰用紡織品等[3,4]，但在實(shí)際應(yīng)用中，殼聚糖纖維也會出現(xiàn)臨床好轉(zhuǎn)反應(yīng)等生物相容性問題，甲殼素、殼聚糖無法完全替代生物機(jī)體的組織.絲素(Silk Febrion)是蠶絲脫膠后的部分，是含有18種氨基酸的復(fù)合蛋白質(zhì)，是具有優(yōu)良生物相容性的天然高分子[5]，近年來由于SF出色的生物相容性，引起了人們對蠶絲基礎(chǔ)及應(yīng)用研究的密切關(guān)注[6]，但是SF在作為醫(yī)用創(chuàng)傷材料臨床使用時柔潤性好但強(qiáng)度不足.為了改善SF膜的性能，本文制備了水溶性甲殼素(6-O-GC，DS=1.0)與SF均勻混合制膜，用親水性的甲殼素衍生物來改善SF的結(jié)構(gòu)特性和力學(xué)性能，以求抑制高結(jié)晶度的SF固體微觀結(jié)構(gòu)的形成和結(jié)晶構(gòu)造的轉(zhuǎn)變，達(dá)到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的SF，使得復(fù)合膜有更好地相容性和柔軟性.這將為仿生化材料和纖維在醫(yī)用材料的研究和應(yīng)用提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化方法和可靠依據(jù).

1 材料、儀器和實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料

甲殼素(Chitin) (DDA=85.7%，MW=27×104，Nihonkayaku公司，日本東京)；絲素蛋白(Silk Fibroin)；日本農(nóng)林水產(chǎn)省蠶絲昆蟲研究所提供；初代皮膚纖維芽細(xì)胞(取自新生兒和二十歲年輕女性)；皮膚纖維芽細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Medium 106SM-106-500S)；低血清增值添加劑(LSGS S-003-10)；抗菌劑(PSA溶液R-004-10)；其他試劑均為分析純(天津試劑廠)，使用前未精制.

1.2 儀器

電子顯微鏡(SEM)，JSM-630IF(Olympus Co., Ltd., Tokyo)；原子間力掃描探針顯微鏡(AFM)，NVB100 (Olympus Co., Ltd., Tokyo)；傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)，F(xiàn)T-IR 8900 (Jasco Co., Ltd., Tokyo).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 絲素蛋白SF水溶液的制備

將蠶繭按文獻(xiàn)[7]的方法處理，首先除去絲膠，得到絲素蛋白，并制成2%(w/w)的絲素蛋白水溶液作為制膜溶液.

1.3.2 6-O-羥乙基甲殼素(6-O-GC)水溶液的制備

將殼聚糖按文獻(xiàn)[8]的方法，先進(jìn)行2位乙?；?取代度DS=1.0)，得到再生甲殼素，再在6位進(jìn)行羥乙基取代，得到可溶于水，收率為82%的6-O-羥乙基化甲殼素(取代度DS=1.0)，然后制成2% (w/w)透明的水溶液用于制膜.

1.3.3 6-O-GC/SF復(fù)合膜的制備

將濃度均為2%(w/w)的6-O-GC水溶液與SF水溶液分別以80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70(v/v)的比例均勻混合，在PFA容器中流延，室溫，濕度60%條件下緩慢干燥，得到厚度約為10μm的薄膜.

1.3.4 在6-O-GC/SF復(fù)合膜上培養(yǎng)人皮膚纖維芽細(xì)胞

選用孔徑為100～120μm的6-O-GC/ SF復(fù)合膜.在6-O-GC/SF復(fù)合膜上培養(yǎng)37 ℃解凍后的成活率為85%(數(shù)量100 萬)的新生兒初代皮膚纖維芽細(xì)胞和年輕婦女初代皮膚纖維芽細(xì)胞，以 5×105個/孔接種至復(fù)合膜上.培養(yǎng)基用人皮膚纖維芽細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用前進(jìn)行消毒處理，并向其中加入LSGS和PSA溶液.取10 mL帶細(xì)胞的培養(yǎng)液放入培養(yǎng)皿中，放入37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約10天，當(dāng)細(xì)胞形成80%時，脫出并用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)后細(xì)胞的生長過程并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 6-O-GC/SF復(fù)合膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

使用FT-IR對6-O-GC/SF復(fù)合膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征.如圖1所示，6-O-GC (7′)在1 658(酰胺I) cm-1、1 560(酰胺II) cm-1有吸收；純SF在1 658(酰胺I)、1 544(酰胺II)有吸收；然而6-O-GC/SF復(fù)合膜(4′-6′)在酰胺I有1 656 cm-1和1 625 cm-1兩個吸收峰；酰胺II的吸收由1 544變成1 551 cm-1.

這說明：復(fù)合膜中除了6-O-GC的酰胺I 1 656 cm-1的吸收外，SF無規(guī)則卷曲α-螺旋構(gòu)象的在酰胺Ⅰ處特征峰消失，與6-O-GC復(fù)合后SF轉(zhuǎn)變成β-折疊構(gòu)象，得到了1 625 (酰胺Ⅰ) cm-1的吸收峰.另外，復(fù)合物中6-O-GC的酰胺II在3 295 cm-1、SF的酰胺II在3 279 cm-1有相應(yīng)吸收；并且隨著6-O-GC添加量的增大，酰胺II的吸收向高場移動，說明了6-O-GC與SF兩者之間存在著分子間氫鍵作用.純的6-O-GC膜在1 030 cm-1和1 060 cm-1處出現(xiàn)C-O的伸縮振動峰，說明甲殼素6位上成功引入了羥乙基，并且與SF復(fù)合后振動峰稍有偏移，峰強(qiáng)度有所減弱，表明6-O-GC與SF之間形成分子之間氫鍵，使得分子間距減小形成緊密結(jié)合，呈現(xiàn)良好的相容性.

(1′)純SF (2′)6-O-GC /SF 30/70 (3′)6-O-GC /SF 40/60 (4′)6-O-GC /SF 50/50 (5′)6-O-GC /SF 60/40 (6′)6-O-GC SF 70/30 (7′) 6-O-GC圖1 6-O-GC /SF共混膜的紅外圖

2.2 6-O-GC/SF膜的表面形貌觀察

圖2所示為6-O-GC與SF復(fù)合膜AFM表面形貌觀察，表明：圖2(a)為純SF膜的蛋白質(zhì)呈螺旋立體結(jié)構(gòu)，表面凹凸不平，說明純SF蛋白質(zhì)內(nèi)螺旋結(jié)構(gòu)清晰可見；

圖2(b)為純6-O-GC膜，多糖單分子呈現(xiàn)六元環(huán)正反相連的結(jié)構(gòu)，兩個分子鏈形成螺旋結(jié)構(gòu)，圖中可以明顯看出表面翹曲.由于6-O-GC甲殼素的6位中引入取代度1.0的羥乙基，破壞了甲殼素的分子內(nèi)氫鍵，分子之間氫鍵作用較弱，分散于水中分子之間連接作用減弱，小分子水進(jìn)入大分子空隙之間，干燥后水份揮發(fā)使膜表面不平整；

圖2(c)為6-O-GC/ SF 50/50復(fù)合膜表面明顯比單純SF膜的蛋白質(zhì)螺旋立體構(gòu)造和純6-O-GC膜要分布均勻、平坦光滑.說明在與SF混合后，SF的結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲向β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變，兩種水溶性高分子鏈在水中均能夠很好地舒展，打開了各自的分子間氫鍵，打破了分子間的螺旋結(jié)構(gòu)，并通過氫鍵作用使得兩高分子之間形成了有序排列、連接緊密的均一體系.而且，混合前后SF結(jié)構(gòu)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，濃度較大的SF具有較高的粘度，均有利于與水溶性甲殼素6-O-GC外圍成囊，使得共混膜的均勻性、規(guī)整性提高.共混膜的拉伸強(qiáng)度和初始拉伸模量均有所改善，并隨著6-O-GC含量的增加而有所提高.

(a)純 SF (b)pure 6-O-GC (c)6-O-GC /SF 50/50(10 μm×10 μm×500 nm)圖2 6-O-GC/SF共混膜表面的AFM圖像

2.3 人皮膚纖維芽細(xì)胞的顯微鏡觀察

如圖3可以看出復(fù)合膜體外作為新生兒初代纖維芽細(xì)胞和20歲年輕婦女初代纖維芽細(xì)胞生長的載體，接種后，細(xì)胞基本完成了黏附過程，處于增殖過程中，并逐漸完成了在膜表面的黏附行為.圖 (a)、(d)(×200倍)中為纖維芽細(xì)胞增殖過程，隨著時間的延長，細(xì)胞在復(fù)合膜表面上的黏附數(shù)量增多如圖(b)、(e)(×200倍)，細(xì)胞大小較均一，胞漿豐富，胞體透明，表明兩種纖維芽細(xì)胞生長狀態(tài)均良好；放大的圖(c)、(f)(×400倍)中可以看出細(xì)胞在復(fù)合膜表面貼附形態(tài)良好，單層基本上融合、鋪滿整個膜面，呈梭形緊密排列，比較接近人皮膚纖維芽細(xì)胞的形態(tài).這說明表面結(jié)構(gòu)有序、分布均勻的膜材料利于細(xì)胞的黏附、生長、增殖及分化，具有良好的生物相容性.

(a)、(b)、(c) 新生兒纖維芽細(xì)胞 (d)、(e)、(f) 年輕婦女纖維芽細(xì)胞圖3 6-O-GC /SF共混膜的細(xì)胞培養(yǎng)照片

3 結(jié)論

在甲殼素6位引入羥乙基制備了取代度為1的6-O-GC的水溶液，與SF水溶液均勻混合，得到了厚度10μm左右的彈性、柔軟度良好的薄膜.親水性的6-O-GC使SF變得更加柔軟、具有一定的延展性.

混合后SF的結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲向β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變，表明6-O-GC與SF兩者之間存在著分子間的氫鍵作用，高黏度SF利于與6-O-GC形成更好的結(jié)合，使膜的均勻性、規(guī)整性提高，膜的強(qiáng)度增加.

體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，可以看出細(xì)胞能夠較好地生長和增殖，細(xì)胞在6-O-GC/SF復(fù)合膜上能很好地存活，說明了6-O-GC/SF復(fù)合膜具有良好的生物相容性，以及良好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛能.

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