大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞生物學特性的研究

徐金霞 李家鋒 韓建國 管海虹 崔 群 孫秀英

1.徐州醫(yī)學院口腔醫(yī)學院，江蘇徐州 221004；2.徐州醫(yī)學院附屬徐州市立醫(yī)院口腔頜面外科，江蘇徐州 221002

1968年，F(xiàn)riedenstein等[1]首先發(fā)現(xiàn)在骨髓的體外培養(yǎng)中含有少量梭形貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，可見細胞形成類似骨和軟骨的細胞團塊。Owen等[2]研究也發(fā)現(xiàn)骨髓中存在貼壁的細胞集落，并將其命名為成纖維樣細胞集落形成單位。經(jīng)過大量的研究證實，骨髓中確實存在這類細胞，被稱為骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），它是一種未充分分化的類中胚層細胞，與骨、軟骨及神經(jīng)等組織的起源具有相關(guān)性，可在特定的條件下定向誘導(dǎo)分化為成骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)樣細胞等，具有來源廣泛，免疫排斥反應(yīng)較輕，具有可自體移植和異體移植等優(yōu)勢[3-4]。但是，骨髓中BMSCs的含量極少。本研究采用密度離心法和全骨髓貼壁法，對BMSCs進行體外分離、培養(yǎng)，觀察其增殖及生長的特性。旨在建立一種對BMSCs進行分離、培養(yǎng)及鑒定的實驗方法，并對其生物學特征進行觀察，為進一步體外BMSCs向成骨細胞分化奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

低糖DMEM/F12培養(yǎng)基（10%胎牛血清＋0.1%青鏈霉素，Gibco，Ameriean）；胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）；胰蛋白酶（碧云天生物有限公司）；青鏈霉素（碧云天生物有限公司）；PBS緩沖液（北京中杉金橋公司）；CD29-FITC、CD90-FITC、CD34-FITC兔抗鼠抗體（Biolegend公司，美國）；CCK-8（同仁化學研究所，日本）。

1.2 實驗動物

3周齡健康清潔級SD大鼠，4只，體重約18～20 g，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠BMSCs的分離培養(yǎng) 應(yīng)用頸椎脫臼法處死大鼠，于0.5%的碘伏溶液中浸泡3 min，在無菌條件下取其雙側(cè)股骨和脛骨，PBS漂洗一遍，用含10%胎牛血清的PBS沖洗骨髓腔，收集沖洗液于15 mL離心管中，2 000 rpm離心10 min，吸取中間白色絮狀單核細胞層，所得細胞按1×108/mL密度接種于25 cm×25 cm塑料培養(yǎng)瓶中，加入3～5 mL低糖DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打均勻，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育。

1.3.2 大鼠BMSCs原代培養(yǎng) 將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)5 d，首次更換培養(yǎng)基，棄去未貼壁細胞，此后每2～3天換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.3.3 大鼠BMSCs傳代培養(yǎng) 倒置顯微鏡下觀察，當原代細胞處于80%～90%融合階段時進行傳代培養(yǎng)，一般2～3 d傳代1次。吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基，加入2 mL PBS漂洗一遍，再向瓶內(nèi)加0.25%的胰蛋白酶2～3 mL，消化收集細胞。在室溫下，把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察，當發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮至細胞近圓形時，直接加入5 mL DMEM/F12培養(yǎng)基，低糖DMEM/F12培養(yǎng)基立即終止消化。1 200 rpm離心5 min，棄上清液，加入低糖DMEM/F12培養(yǎng)基，混勻，把細胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，按1︰3的比例傳代。

1.3.4 大鼠BMSCs表面標志物的檢測 取生長良好的第3代細胞BMSCs，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%左右時，吸掉培養(yǎng)基，用0.25%胰蛋白酶室溫消化1～2 min，將貼壁細胞消化分離，1 200 rpm離心5 min后收集細胞，用細胞計數(shù)板計數(shù)細胞量，PBS漂洗2遍，用PBS懸浮細胞，密度為1×106/mL，將收獲的BMSCs按每支流式管2×104個分別和CD29-FITC、CD90-FITC、CD34-FITC單抗反應(yīng)，設(shè)立1支空白對照組，在37℃水溫箱中水浴、避光反應(yīng)30 min，PBS漂洗1遍后，應(yīng)用流式細胞儀（FCM）進行表面抗原的鑒定，應(yīng)用WinMDI2.9軟件分析結(jié)果。

1.3.5 大鼠BMSCs的生長與增殖曲線 取4塊96孔板，將第1、3代細胞以5×103/cm2的密度各接種于每塊培養(yǎng)板的6個孔中，每孔加入低糖DMEM/F12培養(yǎng)基100 μL，在其周圍空白孔中只加入低糖DMEM/F12培養(yǎng)基100 μL作為空白對照孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗孔和對照孔每3天換液1次。此后每2天固定時間，隨機抽取1板，測定光吸收值（OD）。測量時每孔加入CCK-8溶液10 μL以后，繼續(xù)在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h后，觀察培養(yǎng)基顏色變化，直至培養(yǎng)基變?yōu)槌壬?，酶?lián)免疫測定儀設(shè)定檢測波長492 nm，測定OD值。取6孔OD值的均值，以時間為橫坐標，以實驗孔OD值與空白對照孔OD值差值的均數(shù)為縱坐標，應(yīng)用SPSS16.0軟件繪制細胞生長曲線。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫，計量資料采用（x ± s）表示，應(yīng)用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs的細胞形態(tài)學觀察

在原代培養(yǎng)換液之前，倒置顯微鏡下觀察，可見大量血細胞懸浮在培養(yǎng)基中。第5天，首次換液見貼壁細胞大部分呈圓形、橢圓形、部分細胞伸出偽足變成紡錘形或梭形，見圖1。隨著換液非貼壁細胞被逐漸清除；隨著細胞的生長、分化，第8～10天可見其形態(tài)大部分呈梭形，細胞呈單層生長并鋪滿整個培養(yǎng)瓶底。傳代后細胞擴增分化，第3代呈梭形，排列規(guī)則，見圖2。傳至第8代時，細胞增殖能力有所下降，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，大部分呈不規(guī)則形，排列紊亂，呈樹枝狀，見圖 3。

圖1 大鼠BMSCs原代培養(yǎng)第5天觀察結(jié)果（×100）

圖2 大鼠BMSCs傳代培養(yǎng)第3代觀察結(jié)果（×100）

圖3 大鼠BMSCs傳代培養(yǎng)第8代觀察結(jié)果（×100）

2.2 大鼠BMSCs的表面抗原的鑒定

對大鼠第3代細胞進行FCM檢測，結(jié)果顯示CD29的表達率為94.97%，CD90的表達率為88.50%，CD34的表達率為2.23%，見圖4。結(jié)果表明分離培養(yǎng)的第3代細胞表型均一，基本符合BMSCs的表型特點。

2.3 大鼠BMSCs體外培養(yǎng)生長曲線的測定

CCK-8法測定細胞活性并繪制第1、3代細胞增殖曲線，兩組生長曲線近似倒S形。接種后第2～4天細胞活性略降低，經(jīng)過2～3 d的潛伏期后進入對數(shù)生長期，約在第6天到達平臺期，第8天細胞出現(xiàn)生長抑制。實驗組第3代細胞比對照組第1代細胞增殖速度顯著加快，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5。

A：空白對照組；B：CD29；C：CD90；D：CD34圖4 BMSCs表面抗原CD29、CD90及CD34的表達

圖5 第1、3代BMSCs生長曲線

3 討論

BMSCs是一類具有多向分化潛能的組織干細胞，具有強大的自我復(fù)制能力，在組織工程領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[5]。對BMSCs研究的不斷深入，為解決骨、軟骨、神經(jīng)細胞來源匱乏的難題提供了新領(lǐng)域。但是，骨髓中BMSCs含量很低，約為0.001%～0.010%，因此，BMSCs的誘導(dǎo)分化成功與否取決于是否能夠?qū)崿F(xiàn)其體外的分離、培養(yǎng)及擴增。近年來，BMSCs的常用分離方法包括密度離心法、全骨髓培養(yǎng)法、流式細胞儀法和免疫磁珠法。由于流式細胞儀法及免疫磁珠法成本較高、對細胞損傷大，較少使用。骨組織工程理想的種子細胞應(yīng)該具備以下特點：（1）來源廣泛，取材容易；（2）具有較強的自我更新能力；（3）在體外和體內(nèi)易于向成骨細胞定向分化；（4）能適應(yīng)支架材料和受區(qū)的微環(huán)境。本研究采用了密度離心法及全骨髓貼壁法，所得到細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)，可獲得形態(tài)均一，排列規(guī)則，生長穩(wěn)定的第3代細胞，為實現(xiàn)BMSCs體外快速擴增提供實驗依據(jù)，也為其成骨誘導(dǎo)分化奠定了基礎(chǔ)。

然而，迄今關(guān)于BMSCs的鑒定尚無公認的金標準。盡管BMSCs與造血干細胞共同存在于骨髓中，卻不表達造血細胞的表面抗原。已有研究報道，BMSCs的表面標志具有非專一性，主要有 CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD105、SB-10、SH-3、SH-4等多種表面抗原標志呈陽性，不表達骨髓造血干細胞的表面標志，主要有CD34，CD45等[6-7]。本研究檢測了分離得到的細胞的表面標志CD29的表達率為94.97%，CD90的表達率為88.50%，CD34的表達率為2.23%，此結(jié)果與以往文獻報道相吻合[8-9]，與細胞形態(tài)學相結(jié)合，表明分離培養(yǎng)的細胞為BMSCs。由于BMSCs表面標志的非特異性，還沒有篩選BMSCs特異性的分子標志，因此其鑒別主要依據(jù)形態(tài)學和表面標志相結(jié)合的方法進行綜合判斷?？傊狙芯克捎玫拿芏入x心與全骨髓貼壁法是一種行之有效的分離大鼠BMSCs的方法，該細胞具有增殖能力較強，純度較高的特點，可以作為組織工程的種子細胞，為BMSCs成骨誘導(dǎo)分化提供理論依據(jù)，為骨組織工程的臨床應(yīng)用帶來了曙光。

[1] Friedenstien AJ. Precursor cells of mechanocytes[J].Int Rev Cytol，1976，47：327-359.

[2] Owen ME，Cave J，Joyner CJ.Clonal analysis in vitro ofosteogenic differentiation of marrow CFU-F[J].J Cell Sci，1987，87：731-738.

[3] Caplan AI.Mesenchymal stem cells[J].J Orthop Res，1991，9（5）：641-650.

[4] Arnold I，Scott P.Mesenchymal stem cells:building blocks formolecular in the 21st century[J].Trends Mol Med，2001，7（6）：259-264.

[5] Weiss ML，Medicettya S，Bledsoe AR，et a1.Human umbilical cord matrixstem cells:preliminary characterization and effect of transplantation in arodent model of Parkinson’s disease[J].Stem Cells，2006，24（3）：781-792.

[6] Colter DC，Sekiya I，Prockop DJ，et al.Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（14）：7841-7845.

[7] Liu TM，Martina M，Hutmacher DW，et al.Identification of common pathways mediating differentiation of bone marrow and tissue-derived human mesenchymal stem cells into three mesenchymal lineages[J].StemCells，2007，25（3）：750-760.

[8] Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential ofadult human mesenchymal stem cells[J].Science，1999，284（5411）：143-146.

[9] Mareschi K，F(xiàn)errero I，Rustichelli D，et a1.Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow[J].J Cell Biochemistry，2006，97（4）：744-754.