微泡超聲造影劑在臨床治療診斷中的應(yīng)用*

王艷華

(天津市醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，天津 300191)

超聲造影劑的研究經(jīng)歷了三個階段，即以CO2自由微氣泡為代表的第一代無殼膜型造影劑、以Levovist(利聲顯)為代表的第二代含空氣微氣泡有殼膜型造影劑和以SonoVue為代表的第三代含惰性氣體的新型微泡造影劑。微泡超聲造影劑通過改變聚合條件使其聲學特性可以設(shè)計，可為某種成像條件量身定做的造影劑，使粒徑分布更加集中，后方聲衰減微弱，延長體內(nèi)外的存留時間，從而應(yīng)用于不同生理和病理狀態(tài)下及靶向藥物的輸送。微泡超聲造影劑作為靶目標顯像、藥物載體和基因載體，推動了超聲造影在臨床診斷及治療中的應(yīng)用。

1 在臨床診斷中的應(yīng)用

賓建國［1］以廉價和生物相容性好的N－軟酯酰基殼聚糖為膜材料，采用聲振法制備PCMB造影劑，經(jīng)大鼠尾靜脈團注射0.1 ml該造影劑觀察大鼠左心室、肝臟、腎臟超聲造影效果，脫機分析峰值強度(PI)、達峰時間(TTP)、峰值減半時間(HPT)、廓清時間等參數(shù)，并與全氟顯進行造影性能比較。結(jié)果PCMB分布均勻，濃度為(2.88 ±0.45) ×109/ml，直徑為(1.31 ±0.07) μm(99.98%微泡直徑小于8 μm)，表面電位為(55.03 ±3.08)mV;對大鼠左心室、肝臟、腎臟超聲造影圖像清晰，PI和 TTP與全氟顯相近(P＞0.05)，但HPT及廓清時間明顯延長(P＜0.01)，表明N－軟酯?；鶜ぞ厶菫闅つげ牧现苽湫滦统曉煊皠┚哂辛己玫某晫Ρ瘸上裥Ч?。

張雪華等［2］采用機械振蕩法制備載卡莫司汀脂質(zhì)超聲造影劑，顯微鏡下觀察并計算其濃度，馬爾文測量粒徑大小、分布、電位，高效液相色譜法測量藥物的包封率。微泡經(jīng)冷凍干燥與60Co輻照消毒后，經(jīng)兔耳緣靜脈注射，觀察其在兔肝內(nèi)顯像效果。結(jié)果載藥脂質(zhì)造影劑的濃度為(2.6～3.1) ×109/ml，平均粒徑為(1.05± 0.20)μm;卡莫司汀包封率為 42.6% ±0.11%;電位為 － (12.93 ±1.84)mV;經(jīng)兔耳緣靜脈注射后，兔肝內(nèi)可見持續(xù)的增強顯像效果。卡莫司汀脂質(zhì)超聲造影劑增強了顯像效果，為腫瘤的靶向治療提供可能。

采用特異性配體(包括抗體、受體蛋白等)與脂質(zhì)體連接形成靶向免疫脂質(zhì)體超聲造影劑可能是一種很有前途的導向診斷和治療方法。在血栓性疾病的診斷方面，由于早期新鮮血栓的回聲與血液回聲基本相似，因此，超聲對新鮮血栓的檢出率受到限制。如果能制備一種親血栓性靶向超聲造影劑，以此改善血栓的超聲顯影效果，有望提高超聲檢出新鮮血栓的準確性和敏感性。夏紅梅［3］通過生物素－抗生物素蛋白橋連法，制備攜帶血栓靶向配體的脂膜超聲造影劑，以非靶向脂膜微泡為對照，評價靶向微泡配體結(jié)合率及其影響因素。結(jié)果靶向微泡熒光檢測為陽性，對照組為陰性;同時還顯示該血栓靶向微泡配體結(jié)合率達82.96%，對照組僅為 0.92% 和 0.89%。表明生物素－抗生物素蛋白橋連接法可以成功制備血栓靶向脂膜超聲造影劑。

李殿城［4］在研制了新型超聲造影劑，使其具有良好顯影效果的同時，還能夠作為載體攜帶基。試驗中采用薄膜分散法，選用體內(nèi)可降解的二軟脂酰卵磷脂(DPPC)和1，2－二油烯氧基 －3－三甲氨基丙烷(DOTAP)，制備超聲造影劑，以聲諾維超聲造影劑、PBS和水合液作為對照組，比較其基因攜帶能力。采用體內(nèi)、外顯影實驗，觀察自制超聲造影劑的顯影效果和時間。結(jié)果自制超聲造影劑與聲諾維超聲造影劑相比有較好的基因攜帶能力，而聲諾維超聲造影劑與PBS及水合液的攜基因能力無明顯差異。體外超聲顯影顯示，自制超聲造影劑有很好的影像增強效果和較好的基因攜帶能力。

靶向?qū)Ρ瘸暭夹g(shù)［5］是利用超聲微泡表面固有的生物學特性或通過對微泡表面進行特殊處理構(gòu)建成靶向超聲微泡，經(jīng)靜脈注入后能靶向性聚集并較長時間滯留于靶組織或靶器官中，再通過對比超聲(CEU)產(chǎn)生分子水平顯影的一種新興的超聲成像技術(shù)。

有學者將血栓靶向短肽片段精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－絲氨酸(RGDS)連接于脂質(zhì)微泡表面，成功構(gòu)建穩(wěn)定性良好的親血栓靶向超聲微泡［6］。而通過耦聯(lián)劑將抗ICAM－1單抗連接于白蛋白微泡外殼，構(gòu)建了主動性靶向動脈粥樣硬化斑塊的超聲微泡，并證實該微泡可實現(xiàn)對兔腹主動脈內(nèi)膜及粥樣斑塊的有效靶向顯影，使超聲診斷的敏感性顯著提高［7］。

有研究證實［8］，超聲聯(lián)合微泡能夠提高診斷腫瘤的敏感性，也可作為藥物載體，降低藥物的毒副作用。竹紅菌素(HA)是一種脂溶性的光療藥物，臨床用于治療多種疾病，包括皮膚病和腫瘤等，還可抑制細菌增長，并對人體免疫缺陷病毒(HIV)有光致死作用等，有可能成為新一代抗癌藥物，但HA存在一定的光毒性。

劉學兵等［9］采用機械振蕩的方法制備載竹紅菌素脂質(zhì)超聲微泡，并測定其粒徑大小、分布、Zeta電位和包封率、穩(wěn)定性及超聲輻照后藥物釋放情況，采用不同超聲模式觀察微泡在兔VXZ肝腫瘤的顯像效果及過程。結(jié)果表明超聲輻照能夠促使微泡釋放藥物，對兔VXZ肝腫瘤的顯影效果好，符合理想的藥物載體，為實時監(jiān)控下的體內(nèi)定位光動力治療疾病提供了一種新的思路。

2 藥物載體和基因轉(zhuǎn)染的作用

脂質(zhì)微泡作為藥物、基因載體的研究目前已經(jīng)取得了較大的進步。超聲輻照使微泡破裂產(chǎn)生的空化效應(yīng)能夠增加血管壁的通透性及靶向釋放藥物，從而使更多的藥物到達靶組織，超聲聯(lián)合微泡能夠使細胞吸收藥物增加［10］。

紫杉醇對人肝癌HepG2細胞生長有明顯的抑制作用，其作用機制主要表現(xiàn)在DNA合成期及G2/M期阻滯和一定數(shù)量的細胞凋亡［11］。劉瑤等［12］將紫杉醇包裹入微泡，制作成載紫杉醇超聲微泡造影劑，以人肝癌HepG2細胞株為材料，研究載紫杉醇超聲微泡造影劑抑制HepG2細胞生長和誘導其凋亡的作用。結(jié)果載紫杉醇微泡造影劑在一定能量超聲輻照下釋放藥物進入細胞，其對肝癌HepG2細胞有較好的增殖抑制作用，并能夠誘導肝癌HepG2細胞產(chǎn)生凋亡。

載多烯紫杉醇脂質(zhì)微泡(DLLM)物理性質(zhì)較好，超聲輻照能夠促使微泡包裹的藥物釋放［13］。楊?。?4］在實驗中應(yīng)用DLLM聯(lián)合超聲靶向微泡破裂技術(shù)(UTMD)對人胰腺癌細胞株BxPC3的增殖抑制和凋亡誘導作用，實驗表明DLLM聯(lián)合UTMD能夠增加G2/M期細胞阻滯，明顯抑制人胰腺癌BxPC3細胞增殖并促進細胞凋亡誘導作用，在等量藥物劑量下達到藥物有效濃度更高，有利于減少化療藥物的毒副作用，有望成為一種用于胰腺癌綜合治療的新型藥物載體，為探討DLLM聯(lián)合UTMD在胰腺癌治療方面的應(yīng)用價值提供實驗依據(jù)。

伍星［15］首次通過活體研究，證實超聲定位輻照載藥微泡的方法能有效介導藥物集中釋放到腫瘤組織，明顯抑制腫瘤生長。試驗中為觀察超聲定位輻照載紫杉醇脂質(zhì)微泡(PLM)介導藥物釋放的方法對裸鼠人卵巢癌移植瘤的抑制效應(yīng)，對荷瘤鼠進行分組處理，包括超聲定位輻照PLM組、單純靜脈給藥組、超聲定位輻照脂質(zhì)微泡組、單純靜脈輸注PLM組和生理鹽水對照組，結(jié)果各組的腫瘤體積、抑瘤率及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達均有差異(P＜0.01)。超聲定位輻照PLM組的腫瘤體積與質(zhì)量最小，抑瘤率最大，VEGF表達量最低。表明超聲定位輻照PLM的方法能有效介導藥物釋放，具有較強的體內(nèi)抑瘤效果，有望成為新的腫瘤化療給藥方式。

近年利用超聲微泡造影劑增強顯像的同時，還發(fā)現(xiàn)其具有介導目的基因轉(zhuǎn)移的作用［16］。大量實驗［17］證實，在適當劑量超聲輻照下，超聲微泡介導基因轉(zhuǎn)移與傳統(tǒng)單純載體攜帶基因轉(zhuǎn)移相比，目的基因轉(zhuǎn)移、表達效率大大提高。

視網(wǎng)膜母細胞瘤(RB)是嬰幼兒常見的眼內(nèi)惡性腫瘤。目前國內(nèi)治療普遍采用的眼球摘除術(shù)，及放療和化療等，均可引發(fā)諸多不良后果［18］。超聲微泡造影劑作為一種新型的基因轉(zhuǎn)移載體，可達到基因高效、定向的轉(zhuǎn)染目的。周希瑗［19］為探討超聲微泡造影劑在一定能量的超聲波輻照下，介導EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜母細胞瘤(RB)細胞的效率及可行性。將RB細胞分為6組，1組以一定能量的超聲波輻照，2組加適當劑量的微泡造影劑，3組加入質(zhì)粒，4組加入質(zhì)粒與微泡，5組加入質(zhì)粒、微泡，并用一定能量的超聲輻照，6組予脂質(zhì)體與質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24～48 h后觀察EGFP表達，并用RT－PCR進行檢測。同時對1、2組予以染色。結(jié)果超聲微泡介導的DNA質(zhì)粒對RB細胞的轉(zhuǎn)染效率，與脂質(zhì)體介導的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率相似，明顯高于其他實驗組。一定能量和時間的超聲波輻照及適當濃度的微泡，對RB細胞的活性無明顯抑制。表明利用低頻率和一定能量的超聲擊碎攜帶EGFP質(zhì)粒的超聲微泡造影劑，能夠有效地提高DNA質(zhì)粒在RB細胞中的轉(zhuǎn)染效率。

張萍［20］為觀察超聲聯(lián)合微泡對血管平滑肌細胞(VSMCs)周期分布及細胞周期調(diào)節(jié)蛋白激酶(CDK2)和抑制物p27表達的影響，探討超聲聯(lián)合微泡抑制VSMCs增殖的作用機制，采用體外培養(yǎng)的VSMCs經(jīng)血小板衍生生長因子－BB(PDGF－BB)刺激后，以低頻連續(xù)波超聲(頻率1 MHz、聲強為0.3 W/cm2)聯(lián)合脂質(zhì)微泡(1μl/ml)輻照VSMCs 60 s。分別用流式細胞儀、免疫細胞化學法檢測細胞周期分布和細胞周期調(diào)控蛋白 CDK2、p27的表達。結(jié)果 與對照組比較，PDGF－BB刺激組細胞G0～G1期細胞比例下降而S期細胞比例增高(P＜0.01)，CDK2表達上調(diào)而p27表達降低(P＜0.01);與PDGF－BB組相比，超聲聯(lián)合微泡組G0～G1期細胞比例增高 (P＜0.01)，CDK2表達下調(diào)而p27表達增高(P＜0.01)。結(jié)論:超聲聯(lián)合微泡下調(diào)CDK2蛋白和上調(diào)p27蛋白的表達，阻滯細胞周期進程，可能是抑制VSMCs增殖的機制之一。

微泡超聲造影劑的研制成功并應(yīng)用于臨床，使超聲造影聲像圖質(zhì)量得到極大改善，分辨率明顯提高，同時大大減少了偽像，并且能夠?qū)崟r顯示血流灌注情況，提高了超聲造影的臨床診斷水平。

伴隨著超聲造影技術(shù)和微泡超聲造影劑的不斷發(fā)展，超聲造影劑可以攜帶基因及藥物進入體內(nèi)，然后在超聲空化作用下釋放基因及藥物進入細胞內(nèi)，從而達到一定的治療作用，并在未來臨床治療中顯示出巨大潛力。

1 賓建國，吳爵非，黃瑞珠，等.以N－軟酯?；鶜ぞ厶菫闅つさ男滦统曃⑴菰煊皠┑膶Ρ瘸上?中國醫(yī)學影像技術(shù)，2010，26(7):1197

2 張雪華，李映良，全學模，等.載卡莫司汀脂質(zhì)超聲造影劑制備及特性的研究.重慶醫(yī)科大學學報，2009，34(11):1538

3 夏紅梅，高云華，劉政，等.血栓靶向脂膜超聲造影劑的制備與初步評價.中國醫(yī)學影像技術(shù)，2008，24(2):2176

4 李殿城，朱家安，郭微，等.可攜基因超聲造影劑的制備及其體內(nèi)外顯影效果.上海交通大學學報(醫(yī)學版)，2010，30(9):1024

5 Dayton P A，F(xiàn)errara K W.Targeted imaging using ultrasound.JMagn Reson imaging，2002，16(4):362

6 楊鈺楠，高云華，譚開彬，等.攜RGDS超聲造影劑的制備及體外靶向血栓研究.第三軍醫(yī)大學學報，2006，28(6):562

7 李馨，高云華，譚開彬，等.攜CD54單抗的靶向超聲造影劑增強兔腹主動脈內(nèi)膜及粥樣斑塊顯影的實驗研究.中華超聲影像學雜志，2005，14(3):229

8 Sehnelde M.Molecular imaging and ultraound－assisted drug delivery.J Endourol，2008，22(4):95

9 劉學兵，王志剛，許川山，等.載竹紅菌素脂質(zhì)微泡的制備及對兔VXZ肝腫瘤的顯影實驗.中國醫(yī)學影像技術(shù)，2008，24(10):1508

10 TartlSM S，MeCallan J、Lum A F，et al.Therapeutic effeets of paellraxel－ contalnzngultrasoundeontrastagents.Ultrasound Med Biol，2006，32(11):1771

11 何松，沈薇，沈鼎明.體外觀察紫杉醇對肝癌HepG2細胞生長的影響.重慶醫(yī)學，2003，32(3):268

12 劉瑤，康娟，吳小翎，等.載紫杉醇超聲微泡造影劑對人肝癌細胞株HepG2增殖影響及誘導凋亡作用研究.中國超聲醫(yī)學雜志，2008，24(8):676

13 Kang J，Wu X，Wang Z，et al.Antitumor effect of docetaxel－ loaded lipid microbubbles combined with ultrasound－targeted microbubble activation on VX2 rabbit liver tumors.JUltrasound Med，2010，29(1):61

14 楊健，康娟，曾妍，等.載多烯紫杉醇脂質(zhì)微泡增強人胰腺癌BxPC3細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用.南方醫(yī)科大學學報，2012，32(5):618

15 伍星，王志剛，張勇，等.超聲定位輻照載藥微泡治療卵巢癌移植瘤的實驗研究.中國超聲醫(yī)學雜志，2007，23(3):179

16 江珍珍，夏國園，熊中奎，等.超聲微泡介導基因轉(zhuǎn)移在治療纖維化病變中的應(yīng)用.中國醫(yī)學影像技術(shù)，2010，26(5):983

17 孫龍，官泳松，周翔平，等.介入放射學在腫瘤基因治療中的意義.中國介入影像與治療學，2004，1(2):151

18 李濤，張虹，王騫，等.HSV－tk/GCV自殺基因系統(tǒng)對視網(wǎng)膜母細胞瘤的體外抗腫瘤效應(yīng).華中科技大學學報(醫(yī)學版)，2003，10:533

19 周希瑗，鄧鑫，王志剛.超聲微泡介導EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法效率對比.中國超聲醫(yī)學雜志，2006，22(8):564

20 張萍，高云華，劉平，等.超聲聯(lián)合微泡抑制血管平滑肌細胞增殖機制的研究.臨床超聲醫(yī)學雜志，2008，10(12):793