發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的研究進(jìn)展

吳秋林，劉立明，陳堅

1 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室，江蘇 無錫 214122

3 江南大學(xué)食品微生物制造工程實驗室，江蘇 無錫 214122

硫酸軟骨素 (Chondroitin sulfate，CS) 作為糖胺聚糖類大分子酸性多糖，廣泛存在于人體軟骨、肌腱、椎間盤等結(jié)締組織中，與透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素及核心蛋白聚合為蛋白聚糖 (主要成分為硫酸軟骨素)，賦予軟骨凝膠樣特性和抗變形能力，被稱為人體“軟黃金”[1]。鑒于其潛在的醫(yī)藥價值，2010年《中華人民共和國藥典》將硫酸軟骨素列為防治心血管疾病和關(guān)節(jié)病的最佳藥物。同時硫酸軟骨素作為膳食補(bǔ)充劑和保濕劑，廣泛應(yīng)用于食品和化妝品領(lǐng)域[2-3]。硫酸軟骨素二糖單體結(jié)構(gòu)為 4-GlcA-β-1,3-GalNAc-β-1 (GlcA:葡糖醛酸，GalNAc:乙酰半乳糖胺)，由于硫酸化發(fā)生位點(diǎn)的不同，而將硫酸軟骨素主要分為CS-O, A, B, C, D, E, F等類型 (圖1)，其中，動物來源的硫酸軟骨素單體多為CS-A, C[4]。

硫酸軟骨素的工業(yè)化生產(chǎn)是采用酶法、堿法等提取工藝，從氣管、鼻中隔、雞龍骨及鯊魚軟骨等動物軟組織中提取硫酸軟骨素[5]。全世界硫酸軟骨素產(chǎn)業(yè)主要集中于我國，約占據(jù)全球產(chǎn)量的80%，是硫酸軟骨素最大生產(chǎn)國和出口國。盡管我國硫酸軟骨素產(chǎn)業(yè)發(fā)展強(qiáng)勁，但仍然面臨原料生產(chǎn)周期長 (動物軟骨的生產(chǎn)周期較長)、產(chǎn)業(yè)水平不高 (工藝繁瑣、收率不高、質(zhì)量不穩(wěn))、產(chǎn)品質(zhì)量缺陷 (采用γ射線殺菌導(dǎo)致輻射殘留)、污染嚴(yán)重 (產(chǎn)生大量的有機(jī)物和蛋白廢水) 等制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵瓶頸。因此，如何發(fā)展原料豐富、技術(shù)先進(jìn)、質(zhì)量優(yōu)異、清潔環(huán)保的生產(chǎn)工藝是促進(jìn)硫酸軟骨素產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。除動物軟骨組織外，硫酸軟骨素還以莢膜多糖的形式存在于某些微生物細(xì)胞壁上，因此，通過培養(yǎng)微生物細(xì)胞而獲得大量的硫酸軟骨素是最具經(jīng)濟(jì)效益和開發(fā)潛力的生產(chǎn)工藝。發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在：1) 原料來源廣泛，成本低；2) 工藝條件溫和；3) 產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定安全；4) 環(huán)境友好、無污染等。

因此，近年來采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本文就硫酸軟骨素的生產(chǎn)菌株、發(fā)酵工藝及其合成途徑與調(diào)控等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，以促進(jìn)發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

圖1 硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)[4]Fig. 1 Structure of chondroitin sulfate[4].

1 發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素及其類似物

1.1 硫酸軟骨素的生產(chǎn)菌株及其改造

自然界中許多真菌和細(xì)菌等微生物均能合成低聚合度的硫酸軟骨素或其類似物[6]。但作為工業(yè)生產(chǎn)菌株需具備：1) 人畜安全；2) 能利用廉價的糖質(zhì)原料；3) 生長迅速，發(fā)酵周期短；4) 遺傳背景清楚；5) 能大量合成硫酸軟骨素或其類似物等條件。目前研究主要集中在巴斯德桿菌 Pasteurella multocida、大腸桿菌 Escherichia coli和枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis等3種微生物 (表1)。

首先，大腸桿菌作為原核模式微生物，其遺傳背景清楚，同時對其莢膜多糖合成與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究較多，是目前硫酸軟骨素發(fā)酵研究的主要菌株。但E. coli K4發(fā)酵產(chǎn)物為K4CPS，即果糖軟骨素 (4-β-GlcA(Fru)-1,3-β-D-N-GalNAc-1)[7]，需經(jīng)過脫果糖和硫酸化修飾等步驟才能獲得硫酸軟骨素[8]。這些修飾步驟不僅增加工藝復(fù)雜程度、增加生產(chǎn)成本，還會降低目標(biāo)產(chǎn)品的最終得率。雖然P. multocida能合成軟骨素類莢膜多糖，但其為家禽霍亂致病菌[9-11]。因此近年來主要是利用來源于 P. multocida type F的軟骨素合成酶pmCS進(jìn)行體外酶轉(zhuǎn)化法合成軟骨素多糖鏈，但單糖供體成本太高，尚無產(chǎn)量報道。在2010年，美國Amano Enzyme公司利用納豆芽胞桿菌Bacillus natto直接發(fā)酵生產(chǎn)硫酸軟骨素，但產(chǎn)量較低僅為0.24 g/L[6]。作者在篩選獲得一株高產(chǎn)硫酸軟骨素的枯草芽胞桿菌的基礎(chǔ)上[12]，通過發(fā)酵過程優(yōu)化使硫酸軟骨素產(chǎn)量達(dá)到4.2 g/L (32 h)，這是目前公開文獻(xiàn)報道的硫酸軟骨素最高產(chǎn)量?？莶菅堪麠U菌作為硫酸軟骨素生產(chǎn)菌的優(yōu)勢在于：1) 由于是食品級微生物，安全性很高；2) 直接獲得硫酸軟骨素，無需硫酸化修飾。因此枯草芽胞桿菌將是發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的最佳菌株。

表1 生物技術(shù)法生產(chǎn)硫酸軟骨素或類似物Table 1 Progress in biotechnological production of chondroitin and chondroitin sulfate

為了進(jìn)一步提高硫酸軟骨素的產(chǎn)量，Zanfardino 以E. coli O5:K4:H4為出發(fā)菌株，經(jīng)過N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍 (NNNG) 隨機(jī)誘變，以莢膜圈為篩選條件，篩選到1株產(chǎn)量提高80%的突變株 VZ15。進(jìn)一步解析其高產(chǎn)的生理機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其軟骨素合成酶KfoC的第313個密碼子發(fā)生錯義突變 (Arg→Glu)，使得 KfoC對UDP-GalNAc的親和力更強(qiáng)[22]。同時，Cimini在E. coli K4中過量表達(dá)kfoC，將K4CPS產(chǎn)量提高了2倍[23]。上述結(jié)果表明，軟骨素合成酶是影響硫酸軟骨素高效合成的關(guān)鍵酶。通過分析莢膜多糖合成途徑，發(fā)現(xiàn)單糖前體作為多糖聚合酶底物，其含量豐富程度也是影響硫酸軟骨素多糖合成效率的關(guān)鍵因素。為此，Roman在大腸桿菌中過量表達(dá)UDP-葡萄糖脫氫酶 (UDPGDH)，將UDP-GlcA含量提高3倍，不僅沒有提高莢膜多糖的產(chǎn)量，反而降低了3倍左右[24]。這一研究結(jié)果表明，僅僅增加單個前體物質(zhì)的含量對多糖合成酶具有競爭性抑制作用[24]。由于硫酸軟骨素等莢膜多糖的合成涉及到單糖合成、核糖供應(yīng)、酶動力學(xué)反應(yīng)以及膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等步驟。如要提高硫酸軟骨素的產(chǎn)量，可從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)莢膜多糖合成基因簇的表達(dá)，如過量表達(dá)region 2轉(zhuǎn)錄表達(dá)的必需因子rfaH基因，顯著提高了region 2基因表達(dá)水平，使硫酸軟骨素的產(chǎn)量提高了58%[25]。此外，由于E. coli K4的野生質(zhì)粒pK4EC05排斥外源質(zhì)粒，導(dǎo)致重組質(zhì)粒容易丟失，研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵罐培養(yǎng)24 h后重組質(zhì)粒全部丟失，導(dǎo)致重組菌難以擴(kuò)大培養(yǎng)[23]。因此，如何增加目的基因在K4菌株中的穩(wěn)定性成為分子改造的首要目標(biāo)，采用的方法包括：1) 消除內(nèi)源質(zhì)粒，解除排斥性；2) 與內(nèi)源質(zhì)粒兼容的外源質(zhì)粒作為載體；3) 以內(nèi)源質(zhì)粒為載體。但上述策略的重要基礎(chǔ)在于解析質(zhì)粒pK4EC05特性，為此，Cimini等在完成pK4EC05測序的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)其能夠插入外源基因。通過以 pK4EC05為載體在胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)外源基因，并對重組菌成功進(jìn)行了放大培養(yǎng)，最終K4CPS的產(chǎn)量達(dá)到9.2 g/L，為目前報道的最高水平[25]。

1.2 發(fā)酵條件優(yōu)化與提取純化工藝的研究進(jìn)展

盡管枯草芽胞桿菌是工業(yè)生產(chǎn)硫酸軟骨素的潛在生產(chǎn)菌株，但由于研究較晚，尚處于初級階段。而早在1988年就發(fā)現(xiàn)E. coli O10:K4:H4莢膜多糖結(jié)構(gòu)為果糖軟骨素，1996年利用K4菌株進(jìn)行發(fā)酵研究，采用Rodriguez的發(fā)酵培養(yǎng)基，在14 L發(fā)酵罐上培養(yǎng)24 h后，硫酸軟骨素的產(chǎn)量為 300 mg/L[14]。這一研究引發(fā)了發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的研究熱潮。相關(guān)研究主要集中在通過優(yōu)化發(fā)酵條件和改造菌株以提高菌體濃度、硫酸軟骨素產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度。

1.2.1 發(fā)酵條件

1) 碳源：莢膜多糖合成與細(xì)胞生長在營養(yǎng)物質(zhì)和能量方面存在著競爭關(guān)系，因此碳源作為調(diào)節(jié)細(xì)胞生長速率的關(guān)鍵營養(yǎng)元素，其選擇至關(guān)重要。Cimini等比較了葡萄糖和甘油對E. coli K4產(chǎn)莢膜多糖和生長的影響，兩者濃度的增加均能提高莢膜多糖的產(chǎn)量，但甘油更佳[16]。分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)床蛔銜r，葡萄糖濃度的增加會促進(jìn)發(fā)酵液中乙酸等副產(chǎn)物的產(chǎn)生，抑制莢膜多糖的合成。而吸收率較低的甘油能降低糖酵解途徑中的代謝流，減少乙酸等副產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而其濃度的增加更能有效促進(jìn)莢膜多糖的合成。

2) 氧氣：莢膜多糖是組成細(xì)胞壁的重要成分，其高效合成依賴于胞內(nèi)能量狀態(tài)。高溶氧將顯著增加胞內(nèi)能量的供應(yīng)，促進(jìn)多糖的合成。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DO值低于10%時，硫酸軟骨素比合成速率急劇下降，而甘油消耗速率加快，同時在發(fā)酵液中積聚大量有機(jī)酸等副產(chǎn)物[16]。

3) 發(fā)酵工藝：莢膜多糖作為細(xì)胞表面成分，當(dāng)微生物進(jìn)入指數(shù)生長期時開始合成硫酸軟骨素，在穩(wěn)定期后產(chǎn)量達(dá)到最大值。Cimini在高溶氧條件下，通過補(bǔ)充碳氮源使細(xì)胞濃度達(dá)到56 g/L，從而使莢膜多糖產(chǎn)量達(dá)到1.4 g/L (比分批發(fā)酵提高5倍)[16]。但由于副產(chǎn)物的積累，導(dǎo)致細(xì)胞得率和轉(zhuǎn)化率較低。為此，Schiraldi采用新型的微膜生物反應(yīng)器截留微生物細(xì)胞而排除低分子量的副產(chǎn)物，以解除細(xì)胞在高密度培養(yǎng)過程中的副產(chǎn)物抑制作用，將K4CPS的產(chǎn)量提高到了4.73 g/L，細(xì)胞得率達(dá)到0.13 gK4CPS/gcdw。采用這一策略，使硫酸軟骨素的產(chǎn)量比分批發(fā)酵(295 mg/L) 和補(bǔ)料分批發(fā)酵 (1.4 g/L) 分別提高了16倍和3.3倍[17]。

1.2.2 硫酸軟骨素的提取工藝

從發(fā)酵液中提取K4CPS首先經(jīng)過初提，即除去發(fā)酵液中菌體并回收得到初級K4CPS，再經(jīng)膜超濾去除小分子雜質(zhì)，乙醇沉淀得到粗多糖；加入蛋白酶降解蛋白質(zhì)，最后經(jīng)過透析或膜過濾等可得精制K4CPS[14,25]。純化所得K4CPS還需經(jīng)過脫果糖和硫酸化修飾等步驟制成硫酸軟骨素。第一步，用乙酸調(diào)節(jié)pH值至2.8~3.0，100 ℃保溫至少1 h，即可脫去果糖[25]。脫果糖后的軟骨素可以酸形式或甲酯形式經(jīng)過約6步的化學(xué)處理，最終得到CS-A, C, E[15]。但此法的缺點(diǎn)在于只能得到均一的硫酸軟骨素單體，不能在同一多糖鏈的不同位點(diǎn)硫酸化。為解決這一問題，Bedini等提出了循環(huán)保護(hù)策略，首先將GlcA的2,3位醇基乙?；笥醚h(huán)基團(tuán)選擇性保護(hù)GalUAc的4,6位醇基，再在不同條件下循環(huán)打開，使每個二糖單體的單個羥基隨機(jī)解除保護(hù)后被硫酸化，即可得到4位和6位隨機(jī)硫酸化的非均一硫酸軟骨素[8]。此法不但產(chǎn)率高，成本低，而且與醫(yī)藥級CS-A, C非常相似，具有重要的應(yīng)用價值。

2 代謝途徑與基因調(diào)控

2.1 合成基因簇

根據(jù)大腸桿菌莢膜多糖的遺傳學(xué)特征、生物合成方式及其分子結(jié)構(gòu)等特性，可將其分為4大類，即group 1~4[26]。E. coli K4屬于group 2，如圖2所示，其莢膜多糖合成基因簇包括3個功能區(qū)：region 1、region 2和region 3。

其中region 1和region 3主要負(fù)責(zé)新合成多糖鏈的修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)與定位 (功能見表2)[28]。在多糖鏈合成后，region 1中的KpsS和KpsC對其還原性末端進(jìn)行Kdo修飾，其中Kdo由CMP-Kdo供給，而CMP-Kdo則由region 1中的KpsF和KpsU參與合成。同時，KdsD和KdsB也具有合成 CMP-Kdo的功能[29-30]。在完成修飾后，由region 3中KpsM和KpsT組成的ABC-A2型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)負(fù)責(zé)對多糖進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。其中KpsM為膜整合蛋白，包括6個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)；而KpsT則含有一個ATP結(jié)合區(qū)域并具有ATP水解酶活性[31-32]，在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，KpsT通過識別多糖鏈還原性末端的phosphatidyl-Kdo，與多糖鏈相互作用。

圖2 K4莢膜多糖合成基因簇[27]Fig. 2 The gene cluster for K4CPS biosynthesis [27].

表2 與K4CPS合成相關(guān)的蛋白[26,34]Table 2 Proteins involved in the biosynthesis of K4CPS[26,34]

Region 2主要負(fù)責(zé)編碼多糖及其前體合成相關(guān)的酶，多糖結(jié)構(gòu)與基因型有關(guān)。E. coli K4 region 2長達(dá)14 kb (圖2)，包括kfoA~G等7個基因和1個插入序列IS2[27]。其中KfoA和KfoF分別參與了前體物質(zhì)UDP-GalNAc與UDP-GlcA的合成。kfoC是編碼具有雙功能糖基轉(zhuǎn)移酶活性的軟骨素合成酶的基因，該酶N端和C端的糖基轉(zhuǎn)移酶活性位點(diǎn)分別與前體 UDP-GlcA和UDP-GalNAc相結(jié)合[33]，并交替轉(zhuǎn)移到軟骨素多糖鏈的非還原末端，從而延伸軟骨素多糖鏈[34]。與軟骨素比較，K4CPS帶有1個果糖殘基，其添加機(jī)制引起了研究者的興趣。早期預(yù)測可能由含有糖基轉(zhuǎn)移酶活性位點(diǎn)的 KfoG完成，但Krahulec通過同源重組技術(shù)將kfoG基因敲除后，K4CPS結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生預(yù)期的改變，從而否定了這一推測[35]。直到2012年，Trilli才發(fā)現(xiàn)KfoE蛋白為果糖轉(zhuǎn)移酶，并敲除kfoE基因得到生產(chǎn)軟骨素的E. coli (△ kfoE)菌株[36]。另外，在kfoC和kfoD兩基因之間有1個長度為1 331 bp的插入序列IS2，是一個轉(zhuǎn)運(yùn)DNA元件，與轉(zhuǎn)座酶同源性 96%，表明部分基因由其他地方轉(zhuǎn)移過來[27]。

2.2 生物合成途徑

K4CPS在細(xì)胞質(zhì)中合成，并由一系列的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將其轉(zhuǎn)送至細(xì)胞膜表面，最終在細(xì)胞周圍形成一圈黏液層。其合成過程可分為：1) 單糖前體的合成；2) 多糖的聚合與輸出等兩個階段。

2.2.1 單糖前體的合成

以葡萄糖為碳源時，前體物質(zhì)UDP-GlcA和UDP-GalNAc的合成途徑如圖3所示。將葡萄糖從胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)是兩前體合成的第一步，通過PEP-PST轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子和質(zhì)子泵等方式完成。PEP-PST系統(tǒng)作為E. coli吸收葡萄糖的主要方式，在完成葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的同時實現(xiàn)了葡萄糖的磷酸化。隨后以葡萄糖-6-磷酸 (Glc-6-P)為起點(diǎn)，通過兩條代謝途徑而合成UDP-GlcA和UDP-GalNAc。

1) UDP-GlcA的合成：Glc-6-P通過變位酶(Phosphoglucomutase) 轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)，再由尿苷酰二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UTP-glucose-1-phophate uridylyltransferase) 催化Glc-1-P與UTP合成UDP-Glc。UDP-Glc在UDP-葡萄糖脫氫酶 (UDP-glucose dehydrogenase) 催化下氧化脫氫形成UDP-GlcA。

2) UDP-GalNAc的合成：首先，Glc-6-P由葡糖磷酸異構(gòu)酶 (Phosphogluco isomerase) 異構(gòu)為 Fru-6-P，再通過轉(zhuǎn)氨酶 (Glutamine-fructose-6-phophate transaminase) 從谷氨酰胺得到氨基，合成氨基糖GlcN-6-P，磷酸基團(tuán)同樣通過變位酶生成 GlcN-1-P。然后通過乙?；D(zhuǎn)移酶(Glucosamine-1-phosphate N-acetyltransferase) 從乙酰輔酶 A (Acetyl-CoA) 轉(zhuǎn)移乙?；紾lcN-1-P合成GlcNAc-1-P。GlcNAc-1-P在UDP-乙酰葡糖氨二磷酸酶 (UDP-N-acetylglucosamine diphosphorylase) 催化下合成核苷糖UDP-GlcNAc。最后由差向異構(gòu)酶 (UDP-glucose-4-epimerase)異構(gòu)為前體UDP-GalNAc。通過上述生化途徑解析發(fā)現(xiàn)，在單糖前體合成過程中，變位酶和轉(zhuǎn)氨酶是莢膜多糖合成途徑與糖酵解途徑分流的第一個酶，其酶活直接決定莢膜多糖合成途徑代謝通量的大小，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與多糖合成的關(guān)鍵酶。此外脫氫酶 (KfoF) 和異構(gòu)酶 (KfoA)是合成兩前體的最后一個酶，也是控制前體合成的關(guān)鍵步驟，其過量表達(dá)能有效增加前體的合成量[24]。

圖3 K4莢膜多糖前體合成途徑Fig. 3 Biosynthesis pathway for precursor of K4CPS in E. coli K4.

2.2.2 多糖的聚合與輸出

多糖的聚合與輸出緊密相連，由位于細(xì)胞兩極的大型復(fù)合蛋白完成，這種復(fù)合結(jié)構(gòu)有利于聚合形成300 kDa以上的多糖鏈并迅速穿過細(xì)胞內(nèi)外膜運(yùn)輸至胞外[26,37]。這一過程包括 A~D 4步(圖 4)。A：胞質(zhì)中的軟骨素合成酶 (KfoC) 將UDP-GlcA和UDP-GalNAc交替轉(zhuǎn)移至軟骨素多糖鏈的非還原性末端，延伸多糖并釋放出UDP[27]。同時UDP亦能與軟骨素合成酶結(jié)合，推測UDP的結(jié)合能影響合成酶的活性，參與多糖合成的調(diào)節(jié)[38]。多糖鏈形成后再由果糖轉(zhuǎn)移酶(KfoE) 在GlcA的C3位添加果糖殘基，形成完整的K4CPS多糖鏈[36]。B：在多糖鏈聚合的同時，KpsF催化5-磷酸核糖 (Ru5P) 異構(gòu)為5-磷酸阿拉伯糖 (A5P)[39]，再由KpsU蛋白合成Kdo的前體 CMP-Kdo[40]。Kdo為多糖鏈輸出細(xì)胞膜的介質(zhì)，由KpsS和KpsC負(fù)責(zé)在新合成多糖鏈的還原性末端連接上 phosphatidyl-Kdo，起始多糖的輸出[37]。C：新合成的多糖鏈在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中并非其特異性糖鏈結(jié)構(gòu)被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所識別，而是通過多糖鏈還原性末端的磷脂介質(zhì) Kdo與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KpsT相互作用。而KpsT在ATP結(jié)合下發(fā)生構(gòu)象變化并插入細(xì)胞內(nèi)膜，同時KpsM在其周圍形成孔通道。隨后，ATP水解，釋放出能量驅(qū)動KpsMT轉(zhuǎn)運(yùn)子將多糖鏈轉(zhuǎn)移到周質(zhì)空間。D：存在于周質(zhì)空間的KpsE，N端與細(xì)胞膜外膜連接，C端與細(xì)胞膜內(nèi)膜相連，協(xié)助多糖鏈進(jìn)入 KpsD孔通道穿過細(xì)胞膜外膜，并幫助多糖定位到細(xì)胞膜表面[30,41]。莢膜多糖的合成是在一系列合成蛋白與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)同作用下完成的。過量表達(dá)單個蛋白難以提高莢膜多糖的產(chǎn)量，如 Bliss和Silver過量表達(dá)KpsD蛋白，在細(xì)胞外膜形成大量的孔道，打亂了細(xì)胞的滲透平衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[42]。因此莢膜多糖合成基因簇的協(xié)調(diào)表達(dá)對莢膜多糖的合成至關(guān)重要。

2.3 合成基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

大量研究表明，Group 2莢膜多糖的合成取決于微生物細(xì)胞生長的環(huán)境溫度，當(dāng)環(huán)境溫度低于20 ℃時難以合成莢膜多糖，產(chǎn)生這一結(jié)果的機(jī)理在于莢膜多糖合成基因簇受到兩個溫度調(diào)控型啟動子 (σ70啟動子) 的調(diào)控 (圖5)。Region 1啟動子 (PR1) 和Region 3啟動子 (PR3)，分別位于Region 1上游225 bp和Region 3上游741 bp。PR1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一條約為8 kb的多順反子，隨后相繼轉(zhuǎn)錄出一條約1.3 kb的kpsS轉(zhuǎn)錄子[43]。在PR3轉(zhuǎn)錄從 region 3延伸至 region 2過程中，需要RfaH蛋白參與。RfaH與region 3上游30 bp處的ops序列結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄過程中與RNA聚合酶復(fù)合物相互作用，調(diào)節(jié)region 2轉(zhuǎn)錄的正常進(jìn)行。ops序列缺失或 rfaH基因突變均不能產(chǎn)生莢膜多糖[44]。

莢膜多糖合成基因簇的轉(zhuǎn)錄受到多種蛋白的調(diào)節(jié)，主要有H-NS與SlyA。其中，H-NS作為一種整體調(diào)節(jié)蛋白，具有負(fù)調(diào)控作用。其含量非常豐富，可達(dá)105個分子/基因組，能影響E. coli胞內(nèi)約5%的基因表達(dá)[45]。而SlyA作為一種反抑制子，可與 H-NS同時結(jié)合于 DNA并抑制H-NS的結(jié)合，但其表達(dá)受到溫度的控制[45]。因此，可通過溫度調(diào)節(jié)H-NS/SlyA的比例對啟動子進(jìn)行低溫抑制或高溫激活。如圖5所示，在低溫條件下，胞內(nèi)H-NS/SlyA比值較高，濃度很低的SlyA無法抑制H-NS與PR1、PR3結(jié)合，從而阻礙基因簇的轉(zhuǎn)錄。反之，在高溫條件下，隨著SlyA表達(dá)增多，與PR1、PR3的結(jié)合逐步增強(qiáng)，能解除H-NS與DNA的結(jié)合并激活基因簇的轉(zhuǎn)錄。此外，過量的SlyA蛋白將與H-NS形成核蛋白復(fù)合物結(jié)合于基因簇上，進(jìn)一步促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。因此，PR1、PR3的轉(zhuǎn)錄需要SlyA蛋白的高水平表達(dá)，同時其最大化轉(zhuǎn)錄需要 H-NS的參與[46]。

圖4 K4莢膜多糖的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)[41]Fig. 4 Biosynthesis and transportation of the K4 capsular polysaccharide[41]. (A) Synthesis of K4CPS occurs in the cytoplasmic. (B) KpsF and KpsU convert ribulose 5-phosphate (Ru5p) to CMP-Kdo, which is transferred to the reducing terminus of the finished polysaccharide by KpsS and KpsC. (C) Transport across the cytoplasmic membrane is achieved by KpsM and KpsT. (D) Transport to the cell surface requires KpsE and KpsD.

除上述主要調(diào)控蛋白外，還包括一些輔助調(diào)控因子，如整合宿主因子 (Integration host factor，IHF) 可發(fā)揮結(jié)構(gòu)輔助作用，幫助DNA折疊以使核蛋白復(fù)合物結(jié)合到DNA；BipA蛋白通過與核糖體相互作用調(diào)節(jié)某種未知蛋白X的活性，X蛋白再調(diào)節(jié)PR1和PR3的轉(zhuǎn)錄[47]。同時在基因簇中還存在調(diào)節(jié)序列。首先，PR1中含有兩個順式作用元件 (Cis-acting elements) ——conA和conB，其缺失導(dǎo)致37 ℃時的轉(zhuǎn)錄活性降低，而在 20 ℃的條件下無影響。說明還有其他蛋白與元件結(jié)合參與37 ℃時的轉(zhuǎn)錄激活。其次，kpsM 基因起始密碼子 5￠端非轉(zhuǎn)錄區(qū) (741 bp) (Untranslated region，UTR) 會減弱下游基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，但UTR并不含有任何順式作用元件。141~219 bp是介導(dǎo)PR3溫度調(diào)節(jié)的主要區(qū)域，缺失可解除20 ℃的抑制作用，而整個741 bp片段的缺失將極大提高PR3的轉(zhuǎn)錄活性[48]。

圖5 E. coli K4莢膜多糖基因簇的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控Fig. 5 Expression and regulation of capsular gene cluster in E. coli K4.

3 結(jié)論與展望

圍繞發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素這一研究主題，國內(nèi)外研究人員已在高產(chǎn)微生物菌株篩選與改良、發(fā)酵條件優(yōu)化與控制、硫酸軟骨素合成機(jī)制與調(diào)控機(jī)理等方面開展了卓有成效的研究工作，為發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的工業(yè)化奠定了堅實的基礎(chǔ)。然而，發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素工業(yè)化進(jìn)程的關(guān)鍵瓶頸在于較低硫酸軟骨素的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度，其原因在于微生物自身代謝的經(jīng)濟(jì)學(xué)本能和工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境與自然環(huán)境的巨大差異。因此，如何利用基因工程手段獲得高產(chǎn)率的生產(chǎn)菌株和通過發(fā)酵優(yōu)化實現(xiàn)硫酸軟骨素的高效生產(chǎn)是未來的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)，包括：1) 利用代謝工程手段強(qiáng)化硫酸軟骨素的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)途徑；2) 從能量代謝途徑和非牛頓假塑性流體氧氣傳遞效率提高胞內(nèi)能荷水平滿足硫酸軟骨素合成的高能量需求；3) 研究高密度培養(yǎng)細(xì)胞與高強(qiáng)度產(chǎn)物合成的兩階段發(fā)酵策略，實現(xiàn)硫酸軟骨素發(fā)酵法生產(chǎn)的高產(chǎn)量、高產(chǎn)率和高生產(chǎn)強(qiáng)度的統(tǒng)一，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Qu ZH Wang XZ, Ding MX. Cell Biology. 3rd ed. Beijing: Higher Education Press, 2008: 528?529.翟中和, 王喜忠, 丁明孝. 細(xì)胞生物學(xué). 3版. 北京: 高等教育出版社，2008: 528?529.

[2] Zhou S. Health food useful for improving water content of skin, obtained by mixing components including hyaluronic acid, chondroitin sulfate, fish collagen, vitamin C powder, glycine, proline, extract of grape seeds and starch: CN, 102210425A, 2011-10-12.

[3] Wada T, Mano T, Tanouchi M. Composition useful in pharmaceuticals and food-drinks for treating asthenopia, comprises mixture of chondroitin sulfate: WO, 2011136159A1, 2011-03-11.

[4] Schiraldi C, Cimini D, DeRosa M. Production of chondroitin sulfate and chondroitin. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 87(4): 1209?1220.

[5] Lauder R. Chondroitin sulphate: a complex molecule with potential impacts on a wide range of biological systems. Complement Ther Med, 2009, 17(1): 56?62.

[6] Jolly JF, Klimaszewski K, Nakanishi Y, et al. Microbial-derived chondroitin sulfate: US, 20100063001A1, 2009-06-03.

[7] Rrodriguez ML, Jann B, Jann K. Structure and serological characteristics of the capsular K4 antigen of Escherichia coli O5: K4: H4, a fructose-containing polysaccharide with a chondroitin backbone. Eur J Biochem, 1988, 177(1): 117?124.

[8] Bedini E, DeCastro C, DeRosa M, et al. A microbiological-chemical strategy to produce chondroitin Sulfate A,C. Angew Chem Int Ed Engl, 2011, 50(27): 6160?6163.

[9] DeAngelis PL, Gunay NS, Toida T, et al. Identification of the capsular polysaccharides of Type D and F Pasteurella multocida as unmodified heparin and chondroitin, respectively. Carbohydr Res, 2002, 337(17): 1547?1552.

[10] Chong BF, Blank LM, Mclaughlin R, et al. Microbial hyaluronic acid production. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 66(4): 341?351.

[11] Vann WF, Schmidt MA, Jann B, et al. The structure of the capsular polysaccharide (K5 antigen) of urinary-tract-infective Escherichia coli 010:K5:H4. A polymer similar to desulfo-heparin. Eur J Biochem, 1981, 116(2): 359?364.

[12] Liu LM, Wu QL, Liu J, et al. A screening method of chondroitin sulfate production strain and fermentation chondroitin sulfate: CN, 201110127831.1, 2011-05-18.劉立明, 吳秋林, 劉佳, 等. 一種產(chǎn)硫酸軟骨素菌株的篩選方法及用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)硫酸軟骨素: CN, 201110127831.1, 2011-05-18.

[13] Liu LM Liu J, Wu QL. A method to improve the productivity of chondroitin sulfate by fermentation: CN, 201110317393.5, 2011-10-21.劉立明, 劉佳, 吳秋林. 一種提高硫酸軟骨素發(fā)酵強(qiáng)度的生產(chǎn)方法: CN, 201110317393.5, 2011-10-21.

[14] Manzoni M, Bergomi S, Molinari F, et al. Production and purification of an extracellularly produced K4 polysaccharide from Escherichia coli. Biotechnol Lett, 1996, 18(4): 383?386.

[15] Zoppetti G, Oreste. Process for the preparation of chondroitin sulfates from K4 polysaccharede and obtained products: US, 6777398B2, 2002-10-21.

[16] Cimini D, Restaino OF, Catapano A, et al. Production of capsular polysaccharide from Escherichia coli K4 for biotechnological applications. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85(6): 1779?1788.

[17] Schiraldi C, Restaino OF, Cimini D, et al. High cell density cultivation of Escherichia coli K4 in a microfiltration bioreactor: a step towards improvement of chondroitin precursor production. Microb Cell Fact, 2011, 10(1): 10?19.

[18] Suzuki K, Miyamoto K, Kaseyama H. Chondroitin-producing bacterium and method of producing chondroitin: US, 20100151532A1, 2008-06-24.

[19] DeAngelis PL. Chondroitin synthase gene and methods of making and using same: US, 7569386B2, 2005-06-24.

[20] DeAngelis PL, Padgett-McCue AJ. Methods of expressing Gram-negative glycosaminoglycan synthase genes in Gram-positive hosts: US, 7642071B2, 2007-02-01.

[21] Sugiugura N, Koji J. Novel process for preparation of chondroitin fraction: US, 20090155851, 2006-08-23.

[22] Zanfardino A, Restaino OF, Notomista E, et al. Isolation of an Escherichia coli K4 kfoC mutant over-producing capsular chondroitin. Microb Cell Fact, 2010, 9(1): 34?41.

[23] Cimini D, DeRosa M, Viggiani A, et al. Improved fructosylated chondroitin production by kfoC overexpression in E. coli K4. J Biotechnol, 2010, 150(3): 324?331.

[24] Roman E, Roberts IS, Lidholt K, et al. Overexpression of UDP-glucose dehydrogenase in Escherichia coli results in decreased biosynthesis of K5 polysaccharide. Biochem J, 2003, 374(3): 767?772.

[25] DeRosa M, Schiraldi C, Cimini D. Biotechnological production of chondroitin: WO, 2010136435A1, 2009-05-25.

[26] Whitfield C, Roberts IS. Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli. Mol Microbiol, 1999, 31(5): 1307?1319.

[27] Ninomiya T, Sugiura N, Tawada A, et al. Molecular cloning and characterization of chondroitin polymerase from Escherichia coli strain K4. J Biol Chem, 2002, 277(24): 21567?21575.

[28] Roberts IS, Mountford R, Hodge R, et al. Common organization of gene clusters for production of different capsular polysaccharides (K antigens) in Escherichia coli. J Bacteriol, 1988, 170(3): 1305?1310.

[29] Bronner D, Sieberth V, Pazzani C, et al. Expression of the capsular K5 polysaccharide of Escherichia coli: biochemical and electron microscopic analyses of mutants with defects in region 1 of the K5 gene cluster. J Bacteriol, 1993, 175(18): 5984?5992.

[30] Meredith TC, Woodard RW. Characterization of Escherichia coli D-arabinose 5-phosphate isomerase encoded by kpsF: implications for group 2 capsule biosynthesis. Biochem J, 2006, 395(2): 427?432.

[31] Pavelka MS, Wright LF, Silver RP. Identification of two genes, kpsM and kpsT, in region 3 of the polysialic acid gene cluster of Escherichia coli K1. J Bacteriol, 1991, 173(15): 4603?4610.

[32] Nsahlai CJ, Silver RP. Purification and characterization of KpsT, the ATP-binding component of the ABC-capsule exporter of Escherichia coli K1. FEMS Microbiol Lett, 2003, 224(1): 113?118.

[33] Sobhany M, Kakuta Y, Sugiura N, et al. The chondroitin polymerase K4CP and the molecular mechanism of selective bindings of donor substrates to two active sites. J Biol Chem, 2008, 283(47): 32328?32333.

[34] Lidholt K, Fjelstad M. Biosynthesis of the Escherichia coli K4 capsule polysaccharide. A parallel system for studies of glycosyltransferases in chondroitin formation. J Biol Chem, 1997, 272(5): 2682?2687.

[35] Krahulec J, Krahulcová J, Medová M, et al. Influence of KfoG on capsular polysaccharide structure in Escherichia coli K4 strain. Mol Biotechnol, 2005, 30(2): 129?134.

[36] Trilli A, Busiello I, Daly S, et al. Biotechnological production of chondroitin: US, 20120010399A1, 2011-06-24.

[37] Rigg GP, Barrett B, Roberts IS. The localization of KpsC, S and T, and KfiA, C and D proteins involved in the biosynthesis of the Escherichia coli K5 capsular polysaccharide: evidence for a membrane-bound complex. Microbiology, 1998, 144(10): 2905?2914.

[38] Osawa T, Sugiura N, Shimada H, et al. Crystal structure of chondroitin polymerase from Escherichia coli K4. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 378(1): 10?14.

[39] Tzeng YL, Datta A, Strole C, et al. KpsF is the arabinose-5-phosphate isomerase required for 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid biosynthesis and for both lipooligosaccharide assembly and capsular polysaccharide expression in Neisseria meningitidis. J Biol Chem, 2002, 277(27): 24103?24113.

[40] Rosenow C, Esumeh F, Roberts IS, et al. Characterization and localization of the KpsE protein of Escherichia coli K5, which is involved in polysaccharide export. J Bacteriol, 1995, 177(5): 1137?1143.

[41] Corbett D, Roberts IS. Capsular polysaccharides in Escherichia coli. Adv Appl Microbiol, 2008, 65:1?26.

[42] Bliss JM, Garon CF, Silver RP. Polysialic acid export in Escherichia coli K1: the role of KpsT, the ATP-binding component of an ABC transporter, in chain translocation. Glycobiology, 1996, 6(4): 445?452.

[43] Simpson DA, Hammarton TC, Roberts IS. Transcriptional organization and regulation of expression of region 1 of the Escherichia coli K5 capsule gene cluster. J Bacteriol, 1996, 178(22): 6466?6474.

[44] Stevens MP, Clarke BR, Roberts IS. Regulation of the Escherichia coli K5 capsule gene cluster by transcription antitermination. Mol Microbiol, 1997, 24(5): 1001?1012.

[45] McVicker G, Sun L, Sohanpal BK, et al. SlyA protein activates fimB gene expression and type 1 fimbriation in Escherichia coli K-12. J Biol Chem, 2011, 286(37): 32026?32035.

[46] Corbett D, Bennett HJ, Askar H, et al. SlyA and H-NS regulate transcription of the Escherichia coli K5 capsule gene cluster, and expression of slyA in Escherichia coli is temperature-dependent, positively autoregulated, and independent of H-NS. J Biol Chem, 2007, 282(46): 33326?33335.

[47] Rowe S, Hodson N, Griffiths G, et al. Regulation of the Escherichia coli K5 capsule gene cluster: evidence for the roles of H-NS, BipA, and integration host factor in regulation of group 2 capsule gene clusters in pathogenic E. coli. J Bacteriol, 2000, 182(10): 2741?2745.

[48] Xue P, Corbett D, Goldrick M, et al. Regulation of expression of the region 3 promoter of the Escherichia coli K5 capsule gene cluster involves H-NS, SlyA, and a large 5￠ untranslated region. J Bacteriol, 2009, 191(6): 1838?1846.