鴿β-防御素5基因克隆及其抗菌活性

辛勝男，張可心，張名岳，韓宗璽，邵昱昊，劉曉麗，劉勝旺，馬得瑩

1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物營養(yǎng)研究所，黑龍江 哈爾濱 150030

2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/禽傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001

近年來，抗生素濫用所引發(fā)的問題日益受到人們的關(guān)注，因此，研究無污染、無殘留、無毒副作用的新型抗菌制劑代替抗生素作為飼料添加劑已成為畜牧業(yè)要解決的首要問題。抗菌肽是生物體內(nèi)產(chǎn)生的一類具有廣譜抗菌活性的小分子肽，是機體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在抵抗外源病原體的入侵方面發(fā)揮重要作用[1-3]。因此，開展禽 β-防御素研究對于進一步探討禽β-防御素在體內(nèi)、外的作用及其機理具有重要意義。禽β-防御素 (β-defensin，AvBD) 是一類廣泛存在于禽體內(nèi)的抗菌肽，是禽類先天免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，在機體局部抗感染與免疫方面發(fā)揮著重要作用，是機體抵御外界微生物侵襲的第一道化學(xué)屏障，并且具有廣譜抗菌、抗病毒和免疫增強作用，對機體無毒害、無殘留，因此進一步研究禽β-防御素在體內(nèi)、外的作用及其機理具有重要意義。目前已從雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴕鳥和企鵝等禽類體內(nèi)分離到40余種禽β-防御素，其主要分子特征為含有位置保守的6個半胱氨酸殘基組成的3對二硫鍵[4]。大量的研究表明，無論是人工合成還是天然的禽 β-防御素都具有廣譜的抗菌活性，能夠抑制包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、細菌、真菌等在內(nèi)的大量病原微生物的生長[5-8]。另外，其他種的一些防御素還具有抗病毒并提高機體免疫的特性[1,9-12]。禽 β-防御素廣泛分布于機體各個組織器官，包括消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)[3,13-15]。目前，有關(guān)鴿子 β-防御素還尚未見到報道，由于禽β-防御素在禽先天性免疫和獲得性免疫方面均發(fā)揮著重要作用，而骨髓是重要的免疫器官，肝臟又是新陳代謝的重要器官，因此本實驗采用RT-PCR方法從鴿的骨髓和肝臟組織中分別擴增到 2個新的禽 β-防御素基因，并制備了這兩個基因的重組蛋白，同時對這兩個重組蛋白的生物學(xué)特性進行了初步分析，為重組禽 β-防御素在家禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

鴿子3只，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。

1.1.2 菌株與載體

大腸桿菌 (BL21) 株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室禽傳染病研究室保存；四聯(lián)球菌 (ATCC 2835)、金黃色葡萄球菌 (ATCC 29213)、沙門氏菌(ATCC 14028)、枯草芽胞桿菌 (ATCC 9193)、奇異變形桿菌 (ATCC 29245)、嗜酸乳桿菌 (ATCC 4356)、綠膿桿菌 (ATCC 9027)、多殺性巴氏桿菌 (ATCC 6529)、雞白痢菌 (C79-11-S11)、豬霍亂沙門氏菌 (CVCC 2140)、兔波氏桿菌 (ATCC 33222) 均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。pMD18-T載體購自 TaKaRa公司。pGEX-6p-1載體購自Invitrogen公司。

1.1.3 試劑

ExTaq DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、IPTG購自寶生物工程 (大連) 有限公司；M-MLV鼠源反轉(zhuǎn)錄酶、RNA提取 TRizol試劑盒均購自Invitrogen公司；凝膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司；GST Resin蛋白純化試劑盒購自Novagen公司；其他試劑均為分析純。

1.1.4 引物

根據(jù)雞的 AvBD5 (GenBank Accession No. AY534897) 的基因序列，設(shè)計了2對PCR引物分別用于基因克隆與重組蛋白的表達 (表1)。

表1 PCR引物序列與預(yù)期產(chǎn)物長度Table 1 PCR primers and predicted length of product

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

取鴿骨髓、肝臟組織各 0.1 g左右，按照TRizol試劑盒方法提取總RNA，體系為10 μL。

1.2.2 RT-PCR

用DEPC處理過的蒸餾水10.5 μL將上述提取的RNA溶解，混勻后移入另一0.5 mL DEPC處理過的Eppendorf (EP) 管中，依次加入Oligo dT 1.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，70 ℃水浴5 min，冰浴2 min；再于反應(yīng)管中加入4 μL 5×第一鏈合成緩沖液、2 μL DTT，37 ℃水浴2 min；再加入0.5 μL M-MLV鼠源反轉(zhuǎn)錄酶混勻，37 ℃水浴2 h，70 ℃水浴10 min，即為cDNA模板。根據(jù) GenBank上提交的雞 AvBD 5基因序列(GenBank Accession No. AY534897) 設(shè)計一對引物，即P1/P2。

PCR總反應(yīng)體系為25 μL，按ExTaq DNA聚合酶使用說明進行。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察結(jié)果。

1.2.3 基因克隆及序列分析

對大小吻合的目的條帶的 PCR產(chǎn)物按OMEGA凝膠回收試劑盒的步驟進行合并回收，連接 pMD 18-T Simple Vector，提取質(zhì)粒并將PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒送北京六合華大基因股份有限公司進行測序。

1.2.4 禽β-防御素的遺傳進化分析

將得到的鴿AvBD 5序列應(yīng)用DNAStar軟件與已知的禽 β-防御素基因及部分哺乳動物的 β-防御素基因序列做同源性比較，并采用DNAStar中的Clustal V軟件繪制分子遺傳進化樹，分析其遺傳進化關(guān)系。

1.2.5 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建、原核表達及蛋白純化

對原核表達載體 pGEX-6p-1和重組質(zhì)粒進行酶切位點分析，設(shè)計一對表達引物，即P3/P4。

用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切將pMD18-T-AvBD 5亞克隆到表達載體 pGEX-6p-1上，命名為pGEX-P-AvBD 5，將陽性質(zhì)粒進行測序。

將陽性重組質(zhì)粒pGEX-AvBD 5轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21，挑取單個菌落在含有氨芐抗性(Amp) 的 Luria-Bertani (LB) 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)。當OD600值達到0.5時加入IPTG (終濃度為0.6 mmol/L) 進行誘導(dǎo)。分別在2 h、4 h、6 h取菌樣，6 000×g離心5 min，棄上清，向沉淀中加入 80 μL PBS (pH 7.4) 和 80 μL 1×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸10 min后冰浴冷卻，然后進行SDS-PAGE電泳 (積層膠濃度為5%，分離膠濃度為12%)，經(jīng)考馬斯亮藍染色，甲醇-冰乙酸脫色液脫色，用薄層掃描儀進行分析以確定重組蛋白表達量。按照 Novagen蛋白純化試劑盒的說明書進行蛋白純化，并測定蛋白濃度。

1.2.6 重組鴿AvBD5蛋白抗菌活性及理化性質(zhì)的測定

采用菌落計數(shù)法測定重組融合蛋白的抗菌活性。將1.1.2中各株細菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后用相應(yīng)的培養(yǎng)基稀釋細菌至2×106CFU/mL，先用無菌PBS (pH 7.3) 稀釋重組融合蛋白，終濃度分別為10 μg/mL、25 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，各取250 μL分別加入無菌EP管中，同時設(shè) PBS為對照，分別吸取每株細菌培養(yǎng)物10 μL至管中，每組設(shè)3個重復(fù)，37 ℃振蕩孵育3 h后，各管分別加 100 μL的低濃度培養(yǎng)基(LB∶PBS為1∶1 000)，繼續(xù)37 ℃振蕩孵育3 h，將各管樣品分別作不同倍數(shù)的稀釋，每個稀釋度分別取200 μL接種在營養(yǎng)瓊脂平板上，每管分別作3個平行，37 ℃培養(yǎng)箱孵育18 h后，觀察并記錄每個營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落數(shù)量，取相同稀釋度的 3個營養(yǎng)瓊脂平板菌落的平均值作為該稀釋度樣品的菌落數(shù)量。根據(jù)蛋白濃度和稀釋倍數(shù)計算每管原液中的細菌數(shù)量，選取最適合的蛋白濃度計算細菌存活率并繪制重組蛋白抗菌圖。

1.2.7 不同鹽離子濃度對重組鴿AvBD5-GST融合蛋白抗菌活性的影響

用滅菌的去離子水調(diào)整氯化鈉 (NaCl) 的濃度，使終濃度分別為50、100、150 mmol/L。然后用上述含不同NaCl濃度的緩沖液稀釋重組鴿 AvBD5-GST蛋白濃度至 100 mg/L，各取250 μL分別加入無菌離心管中，相應(yīng)NaCl濃度的稀釋液作為陰性對照，分別向每管加入細菌培養(yǎng)物10 μL，每組設(shè)3個重復(fù)，37 ℃振蕩孵育3 h后，各管分別加100 mL相應(yīng)的低濃度培養(yǎng)基，繼續(xù)37 ℃振蕩孵育3 h。方法同1.2.6。

1.2.8 重組鴿AvBD5-GST融合蛋白對溶血活性的影響

用無菌PBS (pH 7.4) 將新鮮雞紅細胞稀釋為2%~3%，用PBS稀釋重組鴿AvBD5-GST融合蛋白，終濃度分別為100、250、500 mg/L，取20 μL分別加入無菌離心管中，同時設(shè)PBS為陰性對照，0.2% Triton X-100為陽性對照，分別向每管加入180 μL稀釋好的紅細胞。每組設(shè)3個重復(fù)，37 ℃孵育1 h，1 000×g離心10 min后取上清，用微量分光光度計測OD560值并計算溶血指數(shù)。每個樣品作3個平行測定，取平均值。

1.2.9 統(tǒng)計分析

抗菌活性以下式計算：細菌的存活率 (%) =存活細菌數(shù)/陰性對照細菌數(shù)×100%。細菌的存活率以平均數(shù)±標準誤±s) 表示。所得數(shù)據(jù)采用SAS8.0軟件的ANOVA法進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴿AvBD5基因的克隆與序列分析

圖1 鴿AvBD 5 RT-PCR產(chǎn)物分析Fig. 1 Analysis of pigeon AvBD5 RT-PCR products. M: DNA marker; 1: bone marrow issues AvBD5 RT-PCR products; 2: liver issues AvBD5 RT-PCR products.

本研究根據(jù)雞AvBD 5的基因序列，設(shè)計1對特異性引物，從鴿骨髓和肝臟組織中分別擴增到2個約200 bp的特異性的目的基因片段，與目的基因大小相符 (圖1)。對目的片段分別進行回收后連接到pMD 18-T Simple載體，對陽性質(zhì)粒測序，測序結(jié)果有兩種，經(jīng)序列分析，基因大小均為201 bp，編碼66個氨基酸，分子內(nèi)含有禽β-防御素的特征性氨基酸結(jié)構(gòu)，即由6個位置保守的半胱氨酸殘基組成，分別在分子內(nèi)形成1~5、 2~4、3~6共3對二硫鍵 (圖2)。氨基酸序列同源性分析表明，這兩個多肽與鴨AvBD5的同源性最高，分別為 87.9% (骨髓) 和 78.8% (肝臟)；與雞AvBD5的同源性分別為84.8% (骨髓)和75.8% (肝臟)。因此，根據(jù)Lynn等命名法，我們將該基因命名為鴿 AvBD 5α (骨髓) 和鴿AvBD 5β (肝臟)。采用DNAStar軟件中Clustal V方法將鴿 β-防御素 5氨基酸序列與其他的AvBDs的序列進行比較，繪制分子遺傳進化樹(圖3)。

圖2 鴿AvBD 5基因的編碼區(qū)核苷酸序列與推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 Alignment of nucleotide and amino acid sequences of pigeon AvBD 5 and the corresponding peptides.

2.2 鴿AvBD 5α、AvBD 5β蛋白表達和純化

經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的菌體與誘導(dǎo)前的菌體相比，誘導(dǎo)后的菌體有一條明顯的特異條帶，與預(yù)期大小 (32 kDa) 相符。誘導(dǎo)2、4、6 h后，表達量無明顯變化，但相比之下誘導(dǎo)4 h左右表達量相對較多 (圖4、5)。

2.3 重組鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β的抗菌活性

本研究采用菌落計數(shù)法，選用4種革蘭氏陽性菌和8種革蘭氏陰性菌作為檢測菌。結(jié)果表明GST標簽蛋白幾乎沒有抗菌活性，而不同濃度重組鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β蛋白對多殺性巴氏桿菌、綠膿桿菌、四聯(lián)球菌和金黃色葡萄球菌均有較強的抗菌活性，對雞白痢沙門氏菌和兔波氏桿菌的抗菌活性較弱，另外重組鴿AvBD 5α的抗菌活性與重組鴿AvBD 5β無顯著差異。當?shù)鞍诐舛葹?00 mg/L時抗菌活性最理想，因此我們選擇重組蛋白濃度為100 mg/L時的抗菌活性數(shù)據(jù)繪制抗菌圖 (圖6)。另外，為了比較不同禽源AvBD 5的抗菌活性高低，我們將雞、鴨、鵝AvBD 5的抗菌活性與鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β的進行比較 (圖6) (雞、鴨、鵝AvBD 5的抗菌活性數(shù)據(jù)引自文獻[16-18])。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其他禽源AvBD 5相比，鴿的AvBD 5α和AvBD 5β對金黃色葡萄球菌、四聯(lián)球菌、綠膿桿菌與兔波士桿菌的抗菌活性較高。對雞白痢沙門氏菌的抗菌活性較低。

2.4 NaCl濃度對重組鴿 AvBD 5α和鴿AvBD 5β的抗菌活性的影響

在高濃度NaCl條件下，重組鴿AvBD 5α和鴿 AvBD 5β蛋白對多殺性巴氏桿菌的抑制作用有降低趨勢，當NaCl濃度為150 mmol/L時，重組蛋白對多殺性巴氏桿菌抗菌活性顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)。與其他禽源β-防御素相比差異也不顯著(P＞0.05) (圖7) (雞、鴨、鵝AvBD 5的抗菌活性數(shù)據(jù)引自文獻[16-18])。

圖3 鴿AvBD 5α、AvBD 5β與禽β-防御素及部分哺乳動物β-防御素基因系統(tǒng)進化樹分析Fig. 3 Phylogenetic relationships based on the sequence of pigeon-AvBD 5α, AvBD 5β, AvBDs and partial mammalian beta-defensins.

圖4 重組pigeon-AvBD 5α融合蛋白表達分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of recombinant pigeon-AvBD 5α fusion protein expressed in the E. coli BL21. 1: supertant; 2: inclusion body; 3: purified protein of pigeon AvBD 5α; 4: purified GST; 5: protein marker; 6: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5α without IPTG induction; 7: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5α on 4 h after induction with IPTG; 8: GST protein; 9: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5α on 2 h after induction with IPTG; 10: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5α on 6 h after induction with IPTG.

圖5 重組pigeon-AvBD 5β融合蛋白表達分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of recombinant pigeon-AvBD 5β fusion protein expressed in the E. coli BL21. 1: supertant; 2: inclusion body; 3: purified protein of pigeon AvBD 5β; 4: purified GST; 5: protein marker; 6: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5β without IPTG induction; 7: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5β on 2 h after induction with IPTG; 8: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5β on 4 h after induction with IPTG; 9: total protein of BL21 containing pigeon-AvBD 5β on 6 h after induction with IPTG; 10: GST protein.

圖6 重組雞AvBD5、鴨AvBD5、鵝AvBD5、鴿AvBD 5α、鴿AvBD 5β和GST蛋白的抗菌活性Fig. 6 The antimicrobial activity of recombinant chicken AvBD5, duck AvBD5, goose AvBD5, pigeon AvBD 5α, pigeon AvBD 5β, and GST against bacterial strains. 1: Staphylococcus acreus; 2: Micrococcus tetragenus; 3: Lactobacillus; 4: Bacillus cereus; 5: Salmonella choleraesuis; 6: E. coli; 7: Pseudomonas aeruginosa; 8: Salmonella; 9: Salmonella pullorum; 10: Proteus mirabilis; 11: Pasteurella multocida; 12: Bordetella bronchiseptica.

2.5 重組鴿AvBD 5α與鴿AvBD 5β融合蛋白對溶血活性的影響

重組鴿AvBD 5α、鴿AvBD 5β融合蛋白對鴨血紅細胞的溶血活性極低，與陰性對照相比差異不顯著 (P＞0.05)。與陽性對照相比差異極顯著 (P＜0.01)，與其他禽源 β-防御素相比差異也不顯著 (P＞0.05) (圖8) (雞、鴨、鵝AvBD 5的抗菌活性數(shù)據(jù)引自文獻[16-18])。

圖7 鹽離子濃度對重組雞、鴨、鵝AvBD5及鴿AvBD5α、鴿AvBD5β抗多殺性巴氏桿菌的影響Fig. 7 Effects of salinity on the antibacterial activity of chicken AvBD5, duck AvBD5, goose AvBD5, pigeon AvBD5α, pigeon AvBD5β against P. multocida.

圖8 重組雞、鴨、鵝AvBD5及鴿AvBD5α、鴿AvBD5β蛋白的溶血活性Fig. 8 The hemolysis activity of recombinant chicken AvBD5, goose AvBD5, pigeon AvBD5α, AvBD5β protein.

3 討論

本研究是據(jù) Lynn等[12]已發(fā)表的雞 AvBD 5 (AY534897) 的基因，設(shè)計特異性引物，采用RT-PCR的方法從鴿的骨髓組織和肝臟組織中分別克隆出2個禽β-防御素基因。cDNA大小均為201 bp，編碼66個氨基酸殘基，這兩個多肽氨基酸同源性為83.3%。分子內(nèi)含有禽β-防御素的特征性氨基酸結(jié)構(gòu)，即由6個位置保守的半胱氨酸殘基組成，分別在分子內(nèi)形成1~5、2~4、3~6共3對二硫鍵。將該基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他物種的 AvBDs氨基酸序列進行同源性比較發(fā)現(xiàn)，該基因與鴨AvBD 5氨基酸同源性最高，分別為 87.9%和 78.8%。因此，將該基因命名為鴿AvBD 5α (骨髓) 和鴿AvBD 5β (肝臟)。這種基因序列多態(tài)性的存在可能是由于基因組中單核苷酸發(fā)生了變異[14]，但多態(tài)性并未影響基因的結(jié)構(gòu)，發(fā)生堿基突變的基因大小仍為201 bp，編碼66個氨基酸。

目前蛋白表達主要有真核表達系統(tǒng)和原核表達系統(tǒng)，原核表達系統(tǒng) (大腸桿菌表達系統(tǒng))是目前常用的表達系統(tǒng)之一，但由于抗菌肽分子小，易被蛋白酶降解，對宿主菌E. coli有很強的殺傷力，因而不能在E. coli中直接表達。此外，小分子表達產(chǎn)物分離、純化較困難，而以融合蛋白形式表達則可克服這些問題，融合表達后再對產(chǎn)物進行裂解純化，會得到有抗菌活性的表達產(chǎn)物。融合蛋白在E. coli BL21中是以包涵體的形式存在，這樣不僅能保護目的蛋白免受蛋白酶降解，也不會影響宿主菌的生長[1-2,9]，從而避免了由于抗菌肽對宿主菌 E. coli較強的殺傷力而不能在 E. coli中直接表達的問題。本實驗選擇了GST基因融合表達系統(tǒng)中的pGEX-6p-1載體對鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β基因進行原核表達。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，大部分蛋白以不溶的、無活性的包涵體形式存在。包涵體是大量表達的重組蛋白形成的致密顆粒，能保護目的蛋白不受蛋白酶降解，而且不影響宿主菌的生長，有利于產(chǎn)物的分離，所以包涵體對于提高重組蛋白的產(chǎn)量和穩(wěn)定性非常重要。由于目的蛋白形成包涵體后不具有生物活性，因此，本試驗采用的Novagen公司的Protein Refolding Kit蛋白純化試劑盒是針對包涵體進行溶解、復(fù)性和透析，并可以使二硫鍵正確折疊，從而純化出有活性的目的蛋白。

禽類的防御素是一種新型抗菌活性肽，它是一類富含精氨酸的陽離子低分子多肽。在禽的先天性免疫中發(fā)揮著重要的作用[15-16]。防御素的正電荷和雙親結(jié)構(gòu)是抗菌的關(guān)鍵，防御素的殺菌活性與精氨酸的含量有關(guān)，精氨酸含量高的殺菌活性強。大量研究表明，無論是重組表達、天然存在或是人工合成的防御素，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性、細菌、真菌、分歧桿菌、霉菌、螺旋體、病毒 (如流感病毒、皰疹病毒、艾滋病病毒)等均具有很強的殺傷活性[1-2,17,19]，具有高效廣譜抗菌作用，無毒副作用，不會使病源微生物菌株變異產(chǎn)生抗藥性[5,13,17-19]。目前，對于禽 β-防御素的抗菌機制還沒有統(tǒng)一的說法，比較公認的說法就是形成離子通道,即防御素通過靜電作用被吸附到細菌表面，然后將疏水端插入細菌膜中，從而改變其膜的結(jié)構(gòu)，在菌膜上造成穿孔從而使細菌裂解死亡[21]。本研究測定了重組鴿AvBD 5α、重組鴿AvBD 5β和GST蛋白對12種細菌的抗菌活性。結(jié)果表明重組鴿AvBD 5α、重組鴿AvBD 5β蛋白對這4種革蘭氏陽性菌和8種革蘭氏陰性菌均有較強的抑制作用，且對不同菌種的抑制作用強弱也有所不同，推測可能與防御素本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)，鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β的序列都富含大量帶正電荷的氨基酸，鴿AvBD 5α含有8個帶正電荷的氨基酸 (7個精氨酸，1個賴氨酸)，鴿AvBD 5β含有8個精氨酸。將鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β與其他禽源β-防御素5比較發(fā)現(xiàn)，其所帶正電荷數(shù)無顯著差異，但鴿 AvBD 5α和鴿AvBD 5β所帶負電荷氨基酸數(shù)目最少 (1個天冬氨酸，2個谷氨酸)，增加了多肽表面的正電荷數(shù)，從而增加了其抗菌活性。但雞AvBD5、鴨AvBD5、鵝 AvBD5對雞白痢沙門氏菌的抗菌活性要高于鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β，這可能是由于防御素自身結(jié)構(gòu)上的差異導(dǎo)致對細菌的選擇和抗性程度的不同。對于大部分細菌來講，鴿 AvBD 5α的抗菌活性明顯高于鴿AvBD 5β，這可能是由于鴿AvBD 5α和鴿AvBD 5β的DNA序列中一些單核苷酸發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換和顛換，這是最常見的一種變異形式，這種變異形式被稱為單核苷酸多態(tài)性，它們可能會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達水平。同時本研究將該重組蛋白的標簽 GST也進行了抗菌活性的測定，結(jié)果表明GST標簽不具有抗菌活性，這也更肯定了重組蛋白的抗菌活性[1-2,9,22]。高濃度NaCl對重組鴿AvBD 5α和重組鴿AvBD 5β的抗菌活性均有一定影響，Tomita等也報道了其他離子對防御素抗菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)某些二價陽離子能夠強烈的抑制防御素的抗菌活性，這表明對抗菌性的影響是由于離子強度而不是特定離子[23-24]。這可能是由于與防御素競爭性地結(jié)合到帶負電荷的細菌表面，從而影響了防御素和細菌質(zhì)膜的結(jié)合，影響防御素殺菌效力的發(fā)揮，還可能是由于高鹽濃度加速某些白細胞的凋亡，影響其趨化作用、吞噬作用，影響防御素的產(chǎn)生。此外，重組鴿AvBD 5α和重組鴿AvBD 5β對紅細胞溶血活性極低，一般來說，溶血作用與肽分子結(jié)構(gòu)中的疏水殘基含量有關(guān)，疏水殘基含量越高則往往溶血作用也越強[25]。這些研究結(jié)果為今后 AvBDs重組蛋白作為一種高效的肽類抗生素和禽類飼料添加劑等應(yīng)用的可能性提供了理論依據(jù)。

目前，對于鴿防御素的研究還有存在很多問題有待進一步探討，本研究克隆出的鴿AvBD 5α、鴿AvBD 5β及其生物學(xué)特性的研究結(jié)果為禽β-防御素代替抗生素成為新一代抗菌制劑提供了理論依據(jù)。

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