黃麗，方維煥,，俞盈，宋厚輝

1 浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 臨安 311300

2 浙江大學(xué)動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所 浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058

光激活定位顯微成像技術(shù) (Photo-activated localization microscopy，PALM) 是最近幾年來才逐漸發(fā)展起來的、可以在活體水平進(jìn)行的、且分辨率達(dá)到納米級(jí)別、并優(yōu)于激光共聚焦和雙光子顯微鏡的新一代三維成像技術(shù)[1-2]。該技術(shù)的原理是采用熒光基團(tuán)修飾技術(shù)，將各種常見的熒光蛋白進(jìn)行突變，突變后的蛋白在光束下 (一般為405 nm激光或者紫外) 被活化，并釋放出光子信號(hào)，然后利用光激活定位顯微鏡進(jìn)行捕獲和識(shí)別，最終可以捕捉到單分子信號(hào)，分辨率達(dá)到5~20 nm或者更高[2]，其中分辨率的高低取決于熒光蛋白的特性。目前可以被光子激活(Photoactivatable，PA) 的熒光蛋白有：PAGFP[3]、 PAmCherry[4]、mEos2[5]、PATagRFP[6]等。如果這些蛋白不被405 nm激光激活，在普通熒光顯微鏡下不呈現(xiàn)任何熒光 (mEos2除外)，在光激活定位顯微鏡下也不釋放任何信號(hào)。但是這些熒光蛋白一旦被激活，PAGFP[3]、PAmCherry[4]、PATagRFP[6]等在普通顯微鏡下將呈現(xiàn)熒光，例如：PAGFP被激活后，在熒光顯微鏡下為綠色熒光。但對(duì)于在普通熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光的mEos2，被405 nm激光激活后，將表現(xiàn)出紅色熒光 (即出現(xiàn)光轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，Photoconvertable)，隨著激發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，綠色熒光越來越弱，而紅色熒光越來越強(qiáng)，且釋放出光子。

病原菌膜蛋白作為潛在的藥物靶位、細(xì)胞受體和納米通道越來越受到研究者的關(guān)注[7-9]。對(duì)于未知功能的膜蛋白，在研究的初始階段仍然需要依賴生物信息學(xué)軟件，通過已公布的基因組學(xué)信息，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)而通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行驗(yàn)證，包括：膜蛋白表達(dá)、純化、鑒定、分離和定位研究等[10]。其中，對(duì)細(xì)菌膜蛋白定位的研究，目前已經(jīng)公布的方法有蛋白酶K實(shí)驗(yàn)和全細(xì)胞 ELISA實(shí)驗(yàn)[10-11]。這兩種方法的原理是：如果膜蛋白暴露在細(xì)胞外部，將會(huì)被蛋白酶K裂解或者被相應(yīng)的抗體識(shí)別。但是這兩種方法共有的缺陷是：如果膜蛋白具有蛋白酶抗性；或者被多糖、脂類等包裹，利用蛋白酶K實(shí)驗(yàn)和全細(xì)胞ELISA鑒定膜蛋白都是無效的[11]。因此，如何設(shè)計(jì)一種精確的實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)菌膜蛋白的定位進(jìn)行直接觀察，一直是困擾研究者的難題。

結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis，Mtb) 是引起肺結(jié)核 (Tuberculosis, TB) 的致病菌，目前全球大約有1/3人口為結(jié)核陽(yáng)性。根據(jù)WHO最新報(bào)告，2010年全球大約有145萬人口死于TB[12]。由于Mtb可以通過空氣傳播，且需要嚴(yán)格的生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室才能進(jìn)行病原學(xué)研究，為了加快Mtb蛋白組學(xué)的研究進(jìn)展，研究人員往往采取非致病性的恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis, Msmeg) 或者卡介苗分枝桿菌(M. bovis BCG) 作為模式菌，通過在非致病菌中表達(dá)Mtb蛋白，來間接研究Mtb蛋白功能[10,13-14]。

為了能夠精確地對(duì) Mtb膜蛋白的定位情況進(jìn)行原位追蹤，本研究采用無致病性的 Msmeg作為模式菌，以結(jié)核分枝桿菌外膜蛋白OmpA作為參考蛋白，應(yīng)用光激活蛋白mEos2和光激活定位顯微成像技術(shù)研究膜蛋白的定位。這是目前為止采用光激活定位顯微成像技術(shù)研究膜蛋白定位的首次報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 化學(xué)試劑、菌株和質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)室所用的化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自Sigma、USP和BD等公司。恥垢分枝桿菌Mc2155為本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌克隆用菌株為DH5α。

1.1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)。恥垢分枝桿菌培養(yǎng)基為 7H9培養(yǎng)基 (液體) 和7H10培養(yǎng)基 (固體)，37 ℃培養(yǎng)。篩選用抗生素濃度：Hygromycin (潮霉素，50~200 mg/L)。

1.2 蛋白酶K實(shí)驗(yàn)

蛋白酶 K實(shí)驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道的方法進(jìn)行[10]。即：將pML003 (表達(dá)結(jié)核分枝桿菌外膜蛋白 OmpA) 質(zhì)粒[10]轉(zhuǎn)化入能夠表達(dá)內(nèi)膜蛋白PhoA (堿性磷酸酶) 的恥垢分枝桿菌ML1301中[15]，裂解或者不裂解細(xì)菌，用蛋白酶 K處理后，分別用對(duì)應(yīng)的抗體通過Western blotting檢測(cè)OmpA (結(jié)核分枝桿菌外膜蛋白A)、PhoA (內(nèi)膜蛋白，堿性磷酸酶)、MspA[16](恥垢分枝桿菌外膜蛋白，porin) 和RNA聚合酶 (RNAP，胞內(nèi)蛋白) 的完整性。

1.3 mEos2和OmpA的融合表達(dá)

1.3.1 mEos2的基因修飾

由于分枝桿菌為高GC含量細(xì)菌，外源基因一般很難在其內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。為此，我們將mEos2蛋白按照恥垢分枝桿菌密碼子進(jìn)行優(yōu)化，在 3￠端加入了HA標(biāo)簽 (由GenScript公司進(jìn)行合成)，并命名為mEos2m。為了便于克隆，在mEos2m基因5￠和3￠端分別加入了PacⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，直接克隆入pUC57載體中，命名為pUC57-mEos2m (由GenScript公司直接提供)。

1.3.2 mEos2m表達(dá)載體以及 mEos2m-OmpA融合表達(dá)載體的構(gòu)建

mEos2m表達(dá)載體的構(gòu)建：通過PacⅠ/Hind Ⅲ雙酶切，將mEos2m片段從pUC57-mEos2m中切下，連接到pML003載體[10](含有分枝桿菌強(qiáng)啟動(dòng)子psmyc) 中，得到mEos2m表達(dá)載體pSL004。

OmpA-mEos2m融合表達(dá)載體的構(gòu)建：采用OmpA-up-PacⅠ/OmpA linker-rev引物對(duì)，以pML003作為模板，PCR擴(kuò)增OmpA片段；然后采用linker mEos2m-fwd/Eos2m-seq2引物對(duì)，以pUC57-mEos2m為模板，PCR擴(kuò)增mEos2m片段；最后采用融合 PCR技術(shù)，以 OmpA-up-PacⅠ/ Eos2m-seq2為引物，以 OmpA片段和 mEos2m片段為模板，擴(kuò)增OmpA-mEos2m片段。融合片段以 PacⅠ和 Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)克隆入 pML003載體[10]，得到 OmpA-mEos2m融合表達(dá)載體pSL005，其中OmpA和mEos2m片段之間含有柔性接頭氨基酸：GSSGSSG。引物名稱和序列如表1所示。

表1 引物名稱和序列Table1 Primers used in this study

1.4 分枝桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

恥垢分枝桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和電穿孔轉(zhuǎn)化采用本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的方法進(jìn)行[17]。即：將分枝桿菌在 100 mL 7H9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.5，離心收獲菌體，用10%預(yù)冷的甘油將菌體洗滌3次，最后用1 mL 10%甘油懸浮菌體 (感受態(tài)細(xì)胞)。電穿孔轉(zhuǎn)換參數(shù)為：1 000 ?，2.5 kV，25 μF。電擊杯寬度為4 mm。

1.5 細(xì)菌的玻片固定

對(duì)于體視顯微鏡，細(xì)菌菌落不需要固定，可以直接進(jìn)行觀察。但是對(duì)于熒光顯微鏡和光激活定位顯微鏡，樣品需要經(jīng)過固定后才能進(jìn)行觀察。固定方法如下：準(zhǔn)備200 μL新鮮的細(xì)菌液，10 000 r/min離心1 min，收集菌體，然后用PBS (8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，定容至 1 L，pH 7.4) 洗滌 2次。用200 μL PBS (含 2%多聚甲醛+0.2%戊二醛) 懸浮細(xì)菌。室溫靜置10 min，離心收集菌體，并用PBS洗滌2次。用200 μL PBS (含0.1%硼氫化鈉，在1 min內(nèi)完成配制過程，直接使用) 懸浮細(xì)菌。室溫靜置7 min，離心收集菌體，并用PBS洗滌 2次，然后用 200 μL PBS懸浮細(xì)菌。取100 μL滴在多聚賴氨酸處理的載玻片 (Fisher公司) 上，室溫靜置15 min。用PBS輕輕洗滌載玻片，洗去未被吸附的菌體，覆上蓋玻片。用擦鏡紙壓拭蓋玻片，輕輕拭去多余的液體。用凡士林封片后，直接用熒光顯微鏡和光激活定位顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.6 顯微成像技術(shù)

本實(shí)驗(yàn)用的顯微鏡有：Zeiss體視熒光顯微鏡 (Stemi2000)，Zeiss正置熒光顯微鏡 (Axio)和PALM光激活定位顯微鏡 (由美國(guó)HHMI的Hess實(shí)驗(yàn)室搭建，詳細(xì)配置見文獻(xiàn)[1])。光激活采用405 nm LED自制光源 (針對(duì)體視熒光顯微鏡和正置熒光顯微鏡) 或者 405 nm激光 (針對(duì)光激活定位顯微鏡)。mEos2m蛋白光轉(zhuǎn)換吸收波峰為573 nm，發(fā)射波峰為584 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 外膜蛋白OmpA (細(xì)胞外loop) 和MspA對(duì)蛋白酶K不敏感

外膜蛋白通常會(huì)有部分 loop區(qū)域暴露在細(xì)胞外面并與外部環(huán)境接觸。如果該loop區(qū)域被蛋白酶K降解，外膜蛋白將因失去完整性而失去活性。為此，我們利用經(jīng)典的蛋白酶 K 實(shí)驗(yàn)[11-18]驗(yàn)證在分枝桿菌中已經(jīng)被證實(shí)的兩個(gè)外膜蛋白OmpA[19]和MspA[16]的細(xì)胞外部分是否會(huì)被蛋白酶K降解，從而推斷其在細(xì)胞膜上的定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雖然暴露在細(xì)胞外面的OmpA的loop區(qū)域可以被 OmpA抗體識(shí)別[19]，但是裸露在細(xì)胞外部的loop并不能被蛋白酶K降解 (圖1A，“whole”)。同樣，對(duì)于熱穩(wěn)定性的八聚體外膜蛋白MspA，用蛋白酶K直接處理裂解的細(xì)胞，MspA也不會(huì)被降解 (圖1D，“l(fā)ysed”)；這說明多聚體蛋白本身對(duì)蛋白酶K不敏感。而超聲波裂解細(xì)胞中的OmpA (圖1A，“l(fā)ysed”)，內(nèi)膜蛋白PhoA (圖1B，“l(fā)ysed”) 和胞內(nèi)蛋白R(shí)NAP (圖1C，“l(fā)ysed”) 對(duì)蛋白酶K都是敏感的。這說明蛋白酶 K實(shí)驗(yàn)并不能作為一個(gè)通用方法檢測(cè)膜蛋白的表面接觸性能，需要進(jìn)一步開發(fā)新的鑒定膜蛋白的方法。

圖1 蛋白酶K敏感性試驗(yàn)Fig. 1 Protease K sensitivity assay. M. smegmatis ML1301 (PhoA, OmpA and MspA expressing strain) whole cells (indicated with “whole”) and lysed cells (indicated with “l(fā)ysed”) were treated with (indicated with “+”) or without (indicated with “-”) protease K. The reactions were terminated by adding protease K inhibitor cocktails. All samples were boiled for 10 min in the presence of protein loading buffer and separated on 10% SDS-PAGE, detected by anti-OmpA, anti-Flag, anti-RNAP and anti-MspA antibodies respectively.

2.2 光激活熒光蛋白 mEos2m和普通綠色熒光蛋白GFP在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)

mEos2m進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，通過 pSL004 (mEos2m表達(dá)載體)、pSL005 (OmpA-mEos2m融合表達(dá)載體) 在恥垢分枝桿菌中進(jìn)行表達(dá)。為了更直觀地區(qū)別 mEos2m和普通的綠色熒光蛋白GFP的不同，我們將pMN406 (GFP) 和pML1429 (OmpA-GFP) 在恥垢分枝桿菌中進(jìn)行表達(dá)。通過熒光體視顯微鏡 (圖2)，發(fā)現(xiàn)mEos2m及其融合蛋白在分枝桿菌中完全可以實(shí)現(xiàn)表達(dá)，在光激活之前 (圖2，“Before PA”)呈現(xiàn)綠色熒光，在光激活之后呈現(xiàn)紅色熒光 (圖2，“After PA”)。而普通的GFP及其融合蛋白，在光激活之前呈現(xiàn)綠色熒光；在光激活后熒光不發(fā)生轉(zhuǎn)換 (圖2)。

圖2 光激活蛋白mEos2m和普通綠色熒光蛋白在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)Fig. 2 Expression of photoactivatable mEos2m and regular GFP in M. smegmatis. The colonies were visualized under Zeiss fluorescent stereomicroscope before being activated under 405 nm LED light (“Before-PA”) or thereafter (“After-PA). The plasmid and corresponding proteins are indicated on top panel. pMS2, an empty plasmid without any inserts, was used as control. 16-fold magnification was employed under microscope. Scale bar=1 mm.

這說明光激活熒光蛋白 mEos2m及其融合蛋白可以在恥垢分枝桿菌中正確表達(dá)且具有光激活現(xiàn)象。這也是進(jìn)行光激活定位顯微鏡操作之前的準(zhǔn)備工作，即：開啟光激活定位顯微鏡之前，必須先用普通的熒光體視顯微鏡或者正置熒光顯微鏡觀察目的蛋白是否具有熒光且呈現(xiàn)光激活現(xiàn)象。這是因?yàn)楣饧せ疃ㄎ伙@微鏡捕捉的是單分子信號(hào)，只有這些單分子信號(hào)達(dá)到一定數(shù)量之后，才能呈現(xiàn)高分辨率圖像，因此需要的成像時(shí)間更長(zhǎng)。比如：普通熒光顯微鏡從觀察、鎖定圖像到拍照僅需要幾分鐘時(shí)間，而通過光激活定位顯微鏡，每個(gè)樣品從上機(jī)調(diào)試到鎖定圖像和拍照至少需要2 h或者更長(zhǎng)。因此，如果對(duì)樣品特性不了解，直接利用PALM調(diào)試，無論在時(shí)間還是金錢上都是一種浪費(fèi)。

2.3 光激活熒光蛋白 mEos2m對(duì)恥垢分枝桿菌形態(tài)的影響

mEos2m與OmpA融合表達(dá)后，融合蛋白將會(huì)被牽引到細(xì)胞膜上，此時(shí)細(xì)胞的形態(tài)可能會(huì)發(fā)生變化。為了進(jìn)一步研究光激活熒光蛋白mEos2m對(duì)單個(gè)細(xì)菌形態(tài)的影響，我們?cè)谡蔑@微鏡下對(duì)菌落形態(tài)進(jìn)行了觀察 (圖3)。由于圖2中的 GFP為普通的綠色熒光蛋白，不呈現(xiàn)任何光激活現(xiàn)象，無法進(jìn)行隨后的PALM分析。所以，我們僅采用mEos2m (pSL004) 和OmpA-mEos2m (pSL005) 融合蛋白表達(dá)菌株進(jìn)行熒光和光激活分析。對(duì)于僅表達(dá)mEos2m的分枝桿菌，表達(dá)的mEos2m蛋白聚集于細(xì)胞內(nèi)部；從形態(tài)上可以看到表達(dá) OmpA-mEos2m融合蛋白的分枝桿菌(圖3B) 比表達(dá)mEos2m單一蛋白的分枝桿菌更“胖”(圖3A，3B)，這一點(diǎn)與預(yù)期一致。

普通的熒光顯微鏡 (包括激光共聚焦) 對(duì)熒光信號(hào)僅能對(duì)熒光進(jìn)行定性觀察，不能進(jìn)行光子捕捉，其最高分辨率僅能達(dá)到200 nm左右，而光激活定位顯微鏡的分辨率已經(jīng)超過了20 nm[1]。這也是本研究采用超分辨率 PALM進(jìn)行膜蛋定位研究的另一目的。

2.4 光激活定位顯微鏡下的膜蛋白

為了進(jìn)一步驗(yàn)證 PALM是否可以用于膜蛋白定位研究，以及膜蛋白在分枝桿菌細(xì)胞膜上的準(zhǔn)確定位，將含有光激活蛋白的分枝桿菌固定于多聚賴氨酸載玻片后，用405 nm激光激發(fā)，然后用PALM觀察 (圖4)。在PALM顯微鏡下，所有的熒光信號(hào)都將以光子的形式釋放出來，每一個(gè)亮點(diǎn)代表一個(gè)單分子信號(hào) (圖4)。圖像中的彩色斑點(diǎn)代表光子信號(hào)距離拍攝鏡頭的遠(yuǎn)近。按照七種色彩，紅橙黃綠青藍(lán)紫依次代表光子距離拍攝鏡頭由近到遠(yuǎn)。然后通過計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算出光子在物體上的分布。由于OmpA-mEos2m融合蛋白主要定位于細(xì)胞膜上，所以通過縱切面 (Y-Z軸，圖4D) 可以看到所有光子信號(hào)形成一個(gè)“桶狀”(Barrel-like) 或者“帶狀”(Belt-like) 結(jié)構(gòu)，而單一的 mEos2m蛋白，由于位于細(xì)胞內(nèi)，在Y-Z縱切面圖中將呈現(xiàn)均勻分布 (圖 4G)。值得一提的是，PALM顯微鏡下的X-Y (橫切面) 和Y-Z (縱切面) 并不需要對(duì)細(xì)菌進(jìn)行物理切割，而是通過軟件轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)三維成像。目前，PALM還處于不斷革新和完善之中，對(duì)光學(xué)配件、計(jì)算機(jī)硬件和軟件系統(tǒng)等都有特殊要求，雖然Zeiss和Nikon等公司已經(jīng)有商品化樣機(jī)出售，但是價(jià)格是激光共聚焦顯微鏡的數(shù)倍。本實(shí)驗(yàn)室使用的PALM 為自行搭建的顯微鏡平臺(tái)，軟件也是在Metlab的基礎(chǔ)上進(jìn)行自主開發(fā)。上述實(shí)驗(yàn)表明：PALM可以用于膜蛋白的精準(zhǔn)定位研究。

圖3 光激活蛋白mEos2m在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)Fig. 3 Expression of photoactivatable mEos2m in M. smegmatis. The bacterial cells expressing mEos2m (A) and OmpA-mEos2m (B) were fixed on slides and visualized under Zeiss fluorescent research microscope. pMS2, an empty plasmid without any inserts, was used as control (C). Scale bar=5 μm.

圖4 外膜蛋白OmpA在恥垢分枝桿菌細(xì)胞膜上的定位Fig. 4 Localization of OmpA in the membrane region of M. smegmatis. The bacterial cells expressing photoactivatable OmpA-mEos2m (A-D) and mEos2m (E-G) were fixed on slides, activated by 405 nm laser, and visualized under a self-built photoactivated localization microscope (PALM).

3 討論

基于光激活原理的超分辨率 PALM顯微成像技術(shù)，也稱為 STORM (Stochastic optical reconstruction microscopy)[20-22]，該技術(shù)通過控制熒光基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)超分辨率成像，克服了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡中存在的諸如衍射等瓶頸問題[23]。目前在PALM 技術(shù)方面走在國(guó)際前沿的實(shí)驗(yàn)室有哈佛大學(xué)Zhuang實(shí)驗(yàn)室、美國(guó)HHMI Hess實(shí)驗(yàn)室、美國(guó) NIH兒童健康和發(fā)育研究所的 Lippincott-Schwartz實(shí)驗(yàn)室等。本實(shí)驗(yàn)室利用PALM技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了膜蛋白的定位研究，并在恥垢分枝桿菌中成功表達(dá)了mEos2m及其融合蛋白，為下一步利用細(xì)菌感染宿主細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)菌追蹤、定位和活體成像奠定了基礎(chǔ)。

除了mEos2m之外，本實(shí)驗(yàn)室還在分枝桿菌中表達(dá)了具有光激活特性的 PAmCherry，PATagRFP及其與OmpA的融合蛋白，這些光激活蛋白都可以作為膜蛋白的標(biāo)記分子，其中mEos2m在單位時(shí)間內(nèi)釋放的光子最多，因此我們選用mEos2m進(jìn)行了詳細(xì)闡述。

除了OmpA外膜蛋白之外，MspA也是在分枝桿菌中被廣泛關(guān)注的外膜蛋白。與 OmpA不同，MspA是一種孔道蛋白，可以形成在煮沸條件下也不會(huì)失去活性的八聚體蛋白[16]，主要負(fù)責(zé)各種親水性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[24]、無機(jī)鹽[15]和小分子藥物轉(zhuǎn)運(yùn)[25]，目前正被用作新型納米通道進(jìn)行核酸納米測(cè)序研究[7]。我們發(fā)現(xiàn)完整的MspA八聚體結(jié)構(gòu)是其功能和定位得以實(shí)現(xiàn)的前提，當(dāng)MspA與mEos2m等任意熒光蛋白融合后，將破壞其八聚體結(jié)構(gòu)的形成，表現(xiàn)為在平板上的菌落形態(tài)與mspA基因敲除株類似 (結(jié)果未列出)，這說明八聚體機(jī)構(gòu)被破壞后，喪失了對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)物的攝取能力。這從另一個(gè)角度也說明對(duì)于自身可以形成多聚體的膜蛋白，與其他蛋白融合表達(dá)時(shí)將可能失去其原有的空間結(jié)構(gòu)。此外，由于MspA對(duì)蛋白酶K不敏感 (圖1A)，無論利用蛋白酶K實(shí)驗(yàn)還是PALM，MspA都不是一個(gè)很好的參考蛋白。這也是在膜蛋白研究領(lǐng)域中的一個(gè)共識(shí)：沒有一種方法對(duì)所有膜蛋白都適合。

PALM作為一種新的三維成像技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是“超分辨率”；這種超分辨率必須借助具有光激活特性的熒光蛋白和能夠捕捉光子的顯微鏡才能實(shí)現(xiàn)，而普通的綠色熒光蛋白和普通的熒光顯微鏡和激光共聚焦都無法達(dá)到這種效果。但是PALM技術(shù)本身也有“缺點(diǎn)”，主要體現(xiàn)在：1) 實(shí)際操作時(shí)間長(zhǎng)。一般對(duì)每個(gè)樣品光信號(hào)捕獲需要的時(shí)間為2~3 h或者更長(zhǎng)。2) 價(jià)格昂貴。目前在全球也只有少數(shù)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室才能擁有，基本上都是自行搭建的平臺(tái)。但是作為一種新型技術(shù)以及科研發(fā)展的需求尤其是納米技術(shù)發(fā)展的需要，超分辨率成像技術(shù)將是未來科學(xué)發(fā)展的趨勢(shì)。尤其是近幾年Zeiss和Nikon等公司推出商品化的樣機(jī)以來，相信PALM將很快在國(guó)內(nèi)普及。

綜上，本實(shí)驗(yàn)室通過光激活蛋白mEos2m成功建立了一種直接用于膜蛋白定位的研究方法，并以非致病性的恥垢分枝桿菌為模型研究致病性的結(jié)核分枝桿菌膜蛋白定位和功能，為膜蛋白的研究提供了新的思路。

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