DNA甲基化數(shù)據(jù)分析方法和軟件應(yīng)用＊

付利娟，夏映曦，何俊琳，劉學(xué)慶，陳雪梅，王應(yīng)雄，丁裕斌△

（重慶醫(yī)科大學(xué)：1.公共衛(wèi)生學(xué)院；2.中醫(yī)藥學(xué)院 400016；3.重慶江陵醫(yī)院 400021）

DNA甲基化作為一種重要的表觀修飾方式，它可在不改變基因序列的情況，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，近年來已成為生命研究的熱點之一［1］。DNA甲基化一旦發(fā)生紊亂，可導(dǎo)致包括腫瘤、胚胎發(fā)育、老年化進(jìn)程以及自身免疫性在內(nèi)的多種疾病狀態(tài)［2］。由于CpG島甲基化所致的抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活是一個可逆轉(zhuǎn)的基因修飾過程，且該逆轉(zhuǎn)過程（CpG島去甲基化）可直接恢復(fù)抑癌基因功能，因此，DNA去甲基化調(diào)控抑癌基因功能的研究已成為腫瘤基因治療的新型手段之一［3］。DNA甲基化的研究手段多樣，其中，DNA甲基化芯片屬高通量、高效率的研究手段之一［4］，在DNA甲基化研究中應(yīng)用非常廣泛，對研究者的要求亦較高。從DNA甲基化基因芯片設(shè)計、芯片數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制、后期的數(shù)據(jù)分析、數(shù)據(jù)的DNA甲基化特異性PCR、COBRA、BSP測序等驗證方法到數(shù)據(jù)的可視化顯示，需要研究者熟悉諸多軟件的使用。本研究將DNA甲基化研究中的質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)分析過程以及常用的軟件使用予以介紹，并探討這些數(shù)據(jù)分析過程中應(yīng)注意的地方。

1 材料與方法

1.1 材料 DNA甲基化原始芯片數(shù)據(jù)，甲基化測序PCR（bisulfite sequence PCR，BSP）數(shù)據(jù)，分析所需各種在線、本地安裝軟件，如 Signal Map、UCSC Genome Browser、Methyprimer、Methyl Primer Express等。

1.2 方法 采用文獻(xiàn)學(xué)習(xí)及軟件學(xué)習(xí)法，分析實驗過程中質(zhì)量控制的必要方法，統(tǒng)計分析各種實驗數(shù)據(jù)，進(jìn)行引物設(shè)計以及研究數(shù)據(jù)的可視化處理等。

2 結(jié) 果

2.1 芯片的設(shè)計與質(zhì)量控制 目前常用的商業(yè)DNA甲基化芯片主要由Roche-nimblegen和Agilent兩個公司生產(chǎn)。芯片包括Chip-on-Chip和 MeDIP-Chip芯片，根據(jù)實驗設(shè)計的需要，可選擇不同的類型。這兩種較常用的甲基化芯片類型包括多種不同分辨率的芯片，芯片雜交的探針既可囊括基因組CpG區(qū)和啟動子區(qū)，亦可專門針對啟動子區(qū)的DNA甲基化。以MeDIP-Chip芯片為例，整個DNA甲基化芯片實驗應(yīng)包括如下質(zhì)控步驟：（1）超聲打斷基因組產(chǎn)生的片段應(yīng)在200～1 000bp范圍內(nèi)；（2）甲基免疫共沉淀過程質(zhì)控應(yīng)選擇明確的甲基化區(qū)域，如印記基因Xist做陽性對照，同時選擇如Actb，Aprt等基因作為非甲基化區(qū)域的對照；（3）通過對基因芯片掃描的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，校正異常雜交信號，去除噪音信號，并通過對信號點（MA-plot）的分布明確信號值的均一性，進(jìn)一步采用相關(guān)分析判斷重復(fù)實驗的再現(xiàn)性和配對樣本間的相關(guān)性；（4）數(shù)據(jù)分析過程質(zhì)量控制，首先要進(jìn)行數(shù)據(jù)的均一化處理以判斷出不同芯片間的DNA甲基化差異，其次是對明確的區(qū)域和整個基因組的差異甲基化區(qū)域進(jìn)行判別，這一過程在Roche-Nimblegen中主要由 NimbleScan v2.5軟件完成［5］。

表1 MethyPrimer設(shè)計的ALKBH3甲基化PCR引物

表2 Methyl Primer Express設(shè)計的ALKBH3甲基化PCR引物

2.2 甲基化數(shù)據(jù)分析 DNA甲基化芯片數(shù)據(jù)結(jié)果，除了可進(jìn)一步進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析外，差異甲基化基因啟動子或CpG島的可視化，如Roche-Nimblegen公司的數(shù)據(jù)可采用Signal Map進(jìn)行閱讀，即導(dǎo)入注釋數(shù)據(jù)和GFF格式的Peak數(shù)據(jù)和log2IP／input數(shù)據(jù)后，可根據(jù)NimbleScan輸出的統(tǒng)計結(jié)果，查找差異DNA甲基化基因的位置、大小、轉(zhuǎn)錄起始與終止區(qū)域、TSS點以及 Log2IP／input值（圖1）［6］。

圖1 甲基化數(shù)據(jù)分析圖

圖2 Methyprimer預(yù)測出ALKBH3基因的兩個CpG島圖

2.3 MSP引物設(shè)計

2.3.1 基因的外顯子區(qū)查找 可在University of California，

Santa Cruz分校的 UCSC Genome Browser數(shù)據(jù)庫（http：／／ge-nome.ucsc.edu／cgi-bin／hgGateway）搜索［7］。除了搜索啟動子區(qū)，研究者還可以根據(jù)目的基因甲基化所在位置，選擇5′-UTR和外顯子區(qū)。具體搜索的方法及限制，可使用搜索引擎搜索如下關(guān)鍵詞“UCSC啟動子查找”。應(yīng)注意的是，UCSC Genome Browser注釋數(shù)據(jù)庫有hg16、17、18和19版，在搜索時，應(yīng)注意選擇搜索的數(shù)據(jù)庫版本與DNA甲基化芯片數(shù)據(jù)的注釋數(shù)據(jù)庫版本相對應(yīng)。除了UCSC數(shù)據(jù)庫外，NCBI的Mapview（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／mapview／index.html）亦可以搜索啟動子區(qū)。搜索引擎的選擇，通常是根據(jù)芯片結(jié)果注釋時所采用的數(shù)據(jù)庫來決定的。更多的情況下，芯片注釋使用的數(shù)據(jù)庫是UCSC Genome Browser。

2.3.2 引物設(shè)計軟件 甲基化芯片結(jié)果驗證最常用的方法是甲基化PCR（methylation specific PCR，MSP）和硫化測序PCR（bisfulfite sequencing PCR，BSP）。甲基化引物設(shè)計是MSP和BSP中的關(guān)鍵。研究者最常用的甲基化引物設(shè)計軟件是在線Methyprimer（http：／／www.urogene.org／methprimer／index1.html）［8］。研究者可將已知的啟動子區(qū)拷貝到該軟件的窗口后，選擇CpG島的大小、限制GC含量等限制條件后，即可自行設(shè)計MSP或BSP引物。通常情況下Methyprimer會在CpG島區(qū)域設(shè)計引物，但有些基因的引物設(shè)計結(jié)果卻并不在軟件預(yù)測的CpG島區(qū)（圖2），如Alkylation Repair Homolog 3（ALKBH3）基因。將該基因啟動子區(qū)、5′UTR區(qū)和CDs區(qū)序列后拷貝到Methyprimer后，軟件預(yù)測出了兩個CpG島，分別位于672～996區(qū)域和1 001～1 131區(qū)域，設(shè)計出的5對MSP引物均全部位于325～542區(qū)域內(nèi)，而非CpG島區(qū)域。因此，這類基因引物的設(shè)計就需要研究者先根據(jù)自己的知識經(jīng)驗來限定CpG島區(qū)，再依據(jù)甲基化引物設(shè)計的要求自行設(shè)計。DNA甲基化引物設(shè)計的原則主要有：（1）引物擴(kuò)增區(qū)域最好位于轉(zhuǎn)錄起始位點（transcription start site，TSS）250bp以內(nèi)；（2）引物至少應(yīng)包括3個以上（多數(shù)情況下4個或更多）CpG；（3）預(yù)測的退火溫度大于55℃［9］。根據(jù)上述要求，設(shè)計的ALKBH3基因引物見表1。令一款由Applied Biosystems公司開發(fā)的免費軟件 Methyl Primer Express（https：／／products.appliedbiosystems.com／ab／en／US／adirect／ab？cmd＝catNavigate2＆catID＝602121＆tab＝Overview）［10］，可本地安裝后使用。該軟件進(jìn)行CpG島預(yù)測后，能夠準(zhǔn)確地設(shè)計出位于CpG島區(qū)域內(nèi)的引物及其擴(kuò)增區(qū)（圖3）。引物設(shè)計時，軟件還會提醒使用者選擇哪個CpG島來設(shè)計引物，設(shè)計出的引物與Methprimer人工設(shè)定的區(qū)域很接近。這個軟件比較簡單易用，推薦初學(xué)者使用這一軟件。熟練者，可將二者結(jié)合使用。利用Methyl Primer Express設(shè)計ALKBH3MSP引物（表1、2）。設(shè) 計 好 的 甲 基 化 引 物 可 通 過 Blast （http：／／medgen.ugent.be／methBLAST／）進(jìn)一步驗證，確保其目標(biāo)擴(kuò)增序列的特異性。此外，Ugent網(wǎng)站http：／／medgen.ugent.be／methprimerdb／search＿primers.php為研究者提供了部分基因甲基化啟動子序列，這些序列均是被研究者實驗過程所驗證的引物。

圖3 Methyl Primer Express預(yù)測CpG島和設(shè)計的甲基化引物起始位點圖

2.4 BSP結(jié)果的可視化 目前，多款軟件被用于BSP結(jié)果的可視化和CpG甲基化位點的統(tǒng)計分析，包括BiQ analyzer，BISMA（Bisulfite Sequencing DNA Methylation Analysis）和QUMA Quantification Tool for Methylation Analysis。BiQ analyzer可視化分析CpG位點功能較強(qiáng)，但是在CpG甲基化與非甲基化的模式作圖和甲基化數(shù)據(jù)分析上有明顯不足［11］。BISMA和QUMA在CpG差異甲基化作圖與數(shù)據(jù)分析上各具優(yōu)勢。

2.4.1 QUMA （http：／／quma.cdb.riken.jp／） QUMA 是 一款使用方便、集成多個分析功能、基于網(wǎng)絡(luò)的CpG甲基化測序結(jié)果分析軟件，它可以整齊地排列測序的原始結(jié)果，分析甲基化圖譜，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較，檢驗測序質(zhì)量以及現(xiàn)實可視化的甲基化模式［6］。利用該網(wǎng)站提供樣本數(shù)據(jù)，分析結(jié)果見圖4。

圖4 QUMA圖示分析甲基化測序結(jié)果

2.4.2 BISMA（http：／／biochem.jacobs-university.de／BDPC／BISMA／） BISMA是一款目前功能更為全面，可視化效果和統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析，最優(yōu)秀的DNA甲基化測序數(shù)據(jù)可視化分析軟件。它可快速抽取上傳的txt或ABI測序格式的原始數(shù)據(jù)文件，輔助分析序列方向，高度自動化的進(jìn)行復(fù)雜計算，去除載體序列，結(jié)果分析快速準(zhǔn)確。同時還可判別測序結(jié)果的質(zhì)量、亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率、檢測堿基缺失或丟失和過濾N位的甲基化。在質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)處理能力較高的情況下，分析并展示CpG甲基化模式，并首次在同類軟件中支持重復(fù)序列的分析［7］，見圖5。

圖5 BISMA分析甲基化測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

3 討 論

DNA甲基化是生命活動過程中常見的表觀遺傳修飾方式之一［12－14］。DNA甲基化異常分兩種類型，一種是CpG島超甲基化（hypermethylation），另一種是低甲基化（hypomethylation）［15］。DNA甲基化異常與許多種類型的疾病發(fā)生相關(guān)，營養(yǎng)、環(huán)境因素同樣可影響DNA甲基化狀態(tài)［2］。此外，由于DNA甲基化的異常狀態(tài)是一種可逆轉(zhuǎn)的生物學(xué)行為，因此，DNA甲基化研究成為目前各中疾病發(fā)生研究領(lǐng)域的熱點之一［16］。DNA甲基化研究，無論是針對某個生理過程還是疾病發(fā)生的機(jī)制探索，均是系統(tǒng)工作，需從甲基化芯片設(shè)計開始，到MSP、BSP等驗證，甚至還包括功能實驗驗證等方面，進(jìn)行周詳?shù)脑O(shè)計與計劃。尤其是在芯片實驗過程中，多個涉及的質(zhì)量控制過程的步驟尤為重要，事關(guān)整個實驗的成敗，因此，應(yīng)在芯片實驗的整個過程執(zhí)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制工作［5］。DNA甲基化芯片的驗證過程主要包括MSP和BSP，引物的設(shè)計亦是實驗中的關(guān)鍵，選擇更好的軟件進(jìn)行引物的設(shè)計，并優(yōu)化設(shè)計好的引物和PCR反應(yīng)條件是實驗成功的前提。BSP結(jié)果的可視化，有助于讀者更直觀地了解甲基化測序驗證結(jié)果。因此，DNA甲基化研究，應(yīng)從多角度控制實驗的設(shè)計和數(shù)據(jù)的產(chǎn)生及結(jié)果的分析。

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