突變型DNA聚合酶β真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)＊

趙四敏，陳旭東，趙國強(qiáng)，董子明

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校：1.病理生理學(xué)教研室；2.微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，河南漯河 462002；鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院：1.微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室；4.病理生理學(xué)教研室，鄭州 450001）

DNA 聚合酶β（DNA polymeraseβ，polβ）是真核細(xì)胞DNA聚合酶家族的一員，為一看家基因，基因全長35kb，位于第8號染色體近著絲點處，有14個外顯子及13個內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄1.4kb mRNA，其啟動子位于主要轉(zhuǎn)錄起始點的上游115bp內(nèi)［1］。從酵母到哺乳類細(xì)胞的polβ均高度保守，并且廣泛分布于哺乳動物細(xì)胞核內(nèi)，其表達(dá)產(chǎn)物是相對分子質(zhì)量為39kD的單鏈小分子蛋白，是真核細(xì)胞中相對分子質(zhì)量最小的DNA聚合酶。polβ主要參與DNA修復(fù)。一系列DNA體外復(fù)制實驗也證實polβ不參與DNA復(fù)制，它的主要功能是參與DNA損傷修復(fù)，尤其是堿基切除修復(fù)（BER），包括短片段和長片段BER，起催化DNA合成填補(bǔ)缺口以及從無嘌呤／嘧啶（AP）位點催化5′末端脫氧核糖磷酸殘基釋放的作用［2－3］。堿基切除修復(fù)是一種重要的真核DNA修復(fù)途徑，它可以除去DNA損傷，包括脫堿基位點氧化損傷，甲基化堿基［4］。

有研究表明，細(xì)胞中polβ基因的突變會導(dǎo)致異常polβ的產(chǎn)生，損害BER功能，也會增加抑癌基因、原癌基因以及其他控制生長的重要基因的突變頻率，從而增加腫瘤的發(fā)生概率。polβ是BER過程的重要組成部分，而BER又是異?；蛐迯?fù)的重要途徑，對于細(xì)胞的正常生長具有至關(guān)重要的作用。polβ異常的細(xì)胞會顯示BER的缺乏和對損傷堿基物質(zhì)的敏感性增加。目前，已在直腸癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、鼻咽癌等多種人類腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了polβ基因突變和（或）表達(dá)異常［5－9］。因此，有必要構(gòu)建人突變型polβ基因真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染入polβ基因敲除的EC 9706細(xì)胞，利用該細(xì)胞株可有效排除本底干擾，確保表達(dá)的是突變型的polβ基因，為進(jìn)一步研究突變型polβ基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞的生物學(xué)影響打下堅實的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、ApaⅠ（Takara公司）；T4DNA 連 接 酶 （Promega 公 司 ）；pGEM-T-easy 克 隆 載 體（Promega公司）；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自QIAGEN公司；異丙基－β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚－β-D-半乳糖苷（X-Gal）購自Invitrogen公司；食管癌突變型及野生型 polβ基因 （Mpolβ及 Wpolβ）、大 腸桿菌 DH5α及TOP10、真核表達(dá)載體pcDNA4-C、polβ基因敲除的EC 9706細(xì)胞均由本實驗室保存；Hislink蛋白純化試劑盒購自Promega公司；G 418購自Gibco公司；脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000）購自Invitrogen公司；DMEM、胎牛血清購自杭州四季青生物工程研究所；引物合成及序列分析均由上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank所提供的polβ基因序列設(shè)計 引 物，引 物 1：5′-TCG GAT CCA TGA GCA AAC GGA AGG CGC CGC AGG AG-3′（BamHⅠ）；引物2：5′-TTG GGC CCT CAT TCG CTC CGG TCC TTG GGT TCC C-3′（ApaⅠ）。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增polβ基因 以 Mpolβ及Wpolβ為模版，利用引物1、引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含BamHⅠ、ApaⅠ酶切位點的目的基因。擴(kuò)增的反應(yīng)體系：10×緩沖液3μL，4×dNTP 2μL，引物1 0.5μL，引物2 0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，Mini-H2O 18.5μL，模版 DNA 5μL，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，35個反應(yīng)循環(huán)，72℃最后延伸5min，產(chǎn)物于－20℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分別從瓊脂糖凝膠中回收目的基因。具體步驟按膠回收試劑盒說明操作。

1.2.3 克隆 將回收的Mpolβ及Wpolβ基因序列與Promega公司的質(zhì)粒載體pGEM-T以摩爾比3∶1的比例混合連接，連接產(chǎn)物16℃過夜，構(gòu)建含有目的基因的重組質(zhì)粒pGEM-TMpolβ及 pGEM-T-Wpolβ，用 CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TOP10株，通過藍(lán)白篩選，挑選白色菌落進(jìn)行PCR鑒定，然后選取插入了目的片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，即獲得了陽性重組質(zhì)粒pGEM-T-Mpolβ及pGEM-T-Wpolβ。

1.2.4 亞克隆 用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pcDNA4-C和鑒 定 正 確 的 pGEM-T-Mpolβ 及 pGEM-T-Wpolβ，分 別 經(jīng)BamHⅠ、ApaⅠ雙酶切后膠回收純化。具體步驟參照膠回收純化試劑盒。在T4DNA連接酶的作用下，16℃過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株感受態(tài)細(xì)胞，產(chǎn)生重組質(zhì)粒pcDNA4-C-Mpolβ及pcDNA4-C-Wpolβ。經(jīng)PCR鑒定，選取鑒定正確細(xì)菌，接種于30mL含氨芐西林的液體培養(yǎng)基中擴(kuò)菌，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒即得重組質(zhì)粒。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和蛋白純化 將本實驗室先前構(gòu)建的質(zhì)粒pcDNA4-C-Mpolβ和pcDNA4-C-Wpolβ分別以脂質(zhì)體包裹的方式轉(zhuǎn)染入polβ基因敲除的EC 9706細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6h后換為含100mL／LBSA的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后G 418篩選2周，G418篩選濃度為700μg／μL，得到穩(wěn)定表達(dá)pcDNA4-C-Mpolβ，pcDNA4-C-Wpolβ的細(xì)胞克隆，收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞使用HislinTM蛋白純化試劑盒純化蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 polβ基因的擴(kuò)增 以 Mpolβ及 Wpolβ為模板，利用引物1、引物2經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得polβ基因序列，在DNA marker 1 000bp處有條帶，可能為1 100bp的目的片段，與該片段的理論值一致，見圖1。

2.2 polβ基因片段的克隆及PCR鑒定 重組質(zhì)粒pGEM-TMpolβ及pGEM-T-Wpolβ經(jīng)轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后，經(jīng)藍(lán)白篩選后分別從兩個氨芐西林陽性的平板上隨機(jī)篩選3個菌落，分別以6個菌落的裂解產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增片段長度大致為1 100bp，與預(yù)期結(jié)果相符，見圖2。

圖1 PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

圖2 pGEM-T-Mpolβ／Wpolβ質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒pcDNA4-C-polβPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 測序及分析結(jié)果 含點突變片段的重組質(zhì)粒與標(biāo)本中的突變完全一致，構(gòu)建載體中外源片段完全忠實于所選標(biāo)本，可應(yīng)用于下游操作。

2.4 polβ基因片段表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 T4連接酶分別連接雙黏的Mpolβ及Wpolβ基因和羥基化后雙黏的pcDNA4-C，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，從每個氨芐西林陽性的平板上隨機(jī)挑選2個菌落溶菌進(jìn)行PCR鑒定，電泳結(jié)果與設(shè)計一致，見圖3。

2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后polβ蛋白的純化 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量約為39kD位置有一條帶，與預(yù)期的融合蛋白大小相符，說明誘導(dǎo)表達(dá)及純化成功，見圖4。

圖4 純化后蛋白SDS-PAGE結(jié)果

3 討 論

polβ基因和腫瘤之間的關(guān)系正受到越來越多的關(guān)注，很多的研究證明它參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，polβ基因突變已經(jīng)在人類結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、小鼠淋巴瘤中得到證實。迄今為止，只有90種腫瘤接受突變與聚合酶β編碼序列關(guān)系的分析，其中35%的腫瘤有polβ基因突變，這種與腫瘤有關(guān)的polβ基因突變只在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)，而在同一患者的正常組織中未發(fā)現(xiàn)polβ突變，這暗示了polβ基因突變是引起腫瘤疾病的自發(fā)突變，此外，在這些腫瘤中存在的polβ基因突變在124個正常個體的polβ基因中都未出現(xiàn)。更有意思的是：polβ定位于8號染色體（p12～p11）短臂的近側(cè)區(qū)，這個區(qū)段在一些人類腫瘤（如結(jié)腸直腸癌，前列腺癌）中經(jīng)常丟失［10］。這些研究表明polβ基因突變和致癌作用間有一定的聯(lián)系。另一個與polβ在腫瘤中作用相一致的證據(jù)就是它與腫瘤抑制因子P53的相互作用［11－12］。P53蛋白可以在一個脫堿基位點穩(wěn)定polβ，P53和polβ相互作用的改變會引起DNA修復(fù)效率的降低，而這可能導(dǎo)致腫瘤疾病的進(jìn)展，如果在人類細(xì)胞表達(dá)87個堿基缺失的polβ基因突變（這種突變已經(jīng)在原發(fā)結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌中發(fā)現(xiàn)［13］），它會比野生型polβ占優(yōu)勢，并且會破壞它的堿基切除活性，很可能在其他的腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)的polβ基因突變有相似的生物學(xué)影響。因此，進(jìn)一步研究polβ及其在DNA修復(fù)中作用的規(guī)律和機(jī)制已經(jīng)成為腫瘤分子機(jī)制深入研究中一個新的領(lǐng)域。本實驗室曾發(fā)現(xiàn)在食管癌高發(fā)區(qū)及非高發(fā)區(qū)食管癌患者中有polβ基因的突變，且其突變形式與已報道的在其他腫瘤中polβ基因的突變形式不盡相同［14－15］。作為該課題的后繼研究，本實驗選擇突變型基因片段構(gòu)建真核表達(dá)載體，為研究突變型polβ的功能及其對腫瘤的影響等作準(zhǔn)備。構(gòu)建突變型pcDNA4-C-polβ真核表達(dá)載體并純化出polβ蛋白可繼續(xù)進(jìn)行其他研究，進(jìn)而深入探討polβ基因突變及功能突變與環(huán)境、遺傳因素等的關(guān)系。

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