Tjp-2沉默增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞解離及侵襲能力＊

王 巍，李 晴，曹志明，孫宏治，丁 峰，李 強(qiáng)，李東升，楊 濤，白 光△

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧錦州 121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科 121001；3.遼寧省錦州市緊急醫(yī)療救援中心 121001）

胰腺癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，是惡性腫瘤中最常見的，多發(fā)生于胰頭部。其發(fā)病率雖只占各種腫瘤的1%～2%，占消化系統(tǒng)惡性腫瘤的8%～16%，呈逐年增長的趨勢。由于胰腺癌發(fā)病隱匿，早期多無明顯癥狀，或僅出現(xiàn)某些非特異性癥狀，加之又缺乏簡單、特異性的診斷方法，因此，多數(shù)患者就診時已為中、晚期。胰腺癌的5年生存率小于5%，目前仍然是預(yù)后最差的實(shí)體腫瘤［1］。目前手術(shù)仍是惟一可能治愈的方法，但是大多數(shù)患者就診時已屬中、晚期，手術(shù)切除率低［2］。

在近期研究中，應(yīng)用cDNA微陣列分析檢測發(fā)現(xiàn)Tjp－2（又名zonula occludens-2，ZO-2）是一種在解離型高轉(zhuǎn)移株P(guān)C－1.0細(xì)胞和非解離型低轉(zhuǎn)移株P(guān)C-1細(xì)胞中的表達(dá)不同且與侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的基因［3］。緊密連接是連接復(fù)合物中最靠近頂點(diǎn)的成分，通過在細(xì)胞間形成連續(xù)的帶狀結(jié)構(gòu)隔離了頂點(diǎn)和側(cè)質(zhì)膜。緊密連接由不同的跨膜蛋白包括occludin，claudin和JAMs組成，這些跨膜蛋白通過腳手架蛋白如ZO蛋白與細(xì)胞骨架相連。ZO蛋白（ZO-1、ZO-2、ZO-3）屬于膜相關(guān)的鳥苷酸激酶（MAGUK）家族，這些蛋白含幾個蛋白－蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域，包括3個PDZ結(jié)構(gòu)域、一個SH3結(jié)構(gòu)域和一個GK結(jié)構(gòu)域，它們主要定位于連接復(fù)合物的膜下區(qū)，把多個完整的膜蛋白交聯(lián)到細(xì)胞質(zhì)表面，產(chǎn)生特殊的膜區(qū)域。Tjp家族有3名成員，分 別 為 Tjp-1（ZO-1）、Tjp-2（ZO-2）和 Tjp-3（ZO-3）。Tjps屬于膜相關(guān)MAGUK的同分異構(gòu)體，參與組成上皮和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。Tjp與連接轉(zhuǎn)膜蛋白的胞質(zhì)側(cè)C端綁定，使其與細(xì)胞骨架肌動蛋白和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成分連接［4］。Paris等［5］已鑒定的一種跨膜蛋白Occludin，可能提供了這些結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，用來源于肌酐肝組織此連接的單克隆抗體鑒定通過免疫電子顯微鏡觀察這種跨膜蛋白專一性地定位于許多不同類型細(xì)胞的緊密連接處。Occludin的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)表明它的氨基端（－NH）和羧基端（－COOH）處于胞質(zhì)側(cè)，兩個胞外環(huán)伸展向細(xì)胞間隙。目前，認(rèn)為Occludin功能廣泛，在細(xì)胞間黏附、移動及調(diào)節(jié)細(xì)胞的通透性等方面起作用。Occludin也可直指參與腦微血管內(nèi)細(xì)胞上的Tjp形成［6］。但是Tjp參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，尤其是與細(xì)胞解離相關(guān)的機(jī)制尚未明確。

本實(shí)驗(yàn)通過分析Tjp-2基因siRNA轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞解離狀態(tài)和侵襲能力的變化，擬證明Tjp-2表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞解離及侵襲能力密切相關(guān)，為臨床上開發(fā)新的靶向治療藥物提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)采用倉鼠胰腺癌細(xì)胞系PC-1，低轉(zhuǎn)移型PC-1細(xì)胞系是由利用BOP誘導(dǎo)的敘利亞倉鼠實(shí)驗(yàn)性胰腺癌模型建立，以RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，并加10%胎牛血清、100 U／mL青霉素G和100μg／mL鏈霉素，于含5%CO237℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 基因轉(zhuǎn)染 TJP-2siRNA（sc-29926）由美國Santa Cruz公司設(shè)計(jì)并合成，選定3個針對不同位點(diǎn)的TJP-2siRNA序列，均已有實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)染效率大于75%。Control siRNA為陰性對照，由美國Santa Cruz公司合成購買；脂質(zhì)體2000和Opti-MEN培養(yǎng)基均購于Invitrogen公司。實(shí)驗(yàn)分組：對照組（Opti-MEN培養(yǎng)基＋PC-1細(xì)胞），陰性對照組（Opti-MEN 培養(yǎng)基＋control siRNA＋PC-1細(xì)胞），轉(zhuǎn)染組（Opti-MEN培養(yǎng)基＋TJP-2siRNA＋PC-1細(xì)胞）。

1.2.2 總RNA的提取及RT-PCR測轉(zhuǎn)染率 Trizol購自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購于大連TaKaRa公司。轉(zhuǎn)染48h后提取總 RNA，TJP-2（245bp）：5′-GCA GAG CGA ACG AAG AGT ATG G（forward）、5′-TGA CGG GAT GTT GAT GAG GGT（reverse）；β-actin（664bp）：5′-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA（forward），5′-CTC CTT AAG TCA CGC ACG ATT CC（reverse）。PCR反應(yīng)條件如下，95℃應(yīng)變性5min，然后94℃30個循環(huán)20s，接著63℃退火30s、72℃延伸1 min，最后72℃7min延伸.PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳并顯影，電壓為120V，電泳時間為40 min，凝膠成像系統(tǒng)對條帶進(jìn)行掃描分析，計(jì)算灰度，以目的條帶與β-actin灰度的比值表示目的條帶的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染抑制率＝（轉(zhuǎn)染前表達(dá)水平－轉(zhuǎn)染后表達(dá)水平）／轉(zhuǎn)染前表達(dá)水平×100%。

1.2.3 Westernblot檢測 實(shí)驗(yàn)以兔多克隆抗體作用于人Tjp-2氨基酸序列及β-actin（Santa Cruz，CA）作為一抗，利用辣根過氧化物酶結(jié)合的抗體和FITC標(biāo)記的熒光抗體（Santa Caruz，CA）作為第二抗體。裂解各組細(xì)胞制備蛋白樣本后，取20 g裂解提取物用聚丙烯酰胺平板凝膠電泳，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，然后將PVDF膜與0.1%Tween-20／PBS稀釋的一抗共同于4℃下孵育過夜，一抗孵育后的膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗以1∶2 000比例再加0.1%Tween-20／PBS稀釋共同孵育，利用Kodak scientific imaging film（eastman kodak company，rochester，NY），加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑（Santa Cruz，CA）以探測收集蛋白條帶光信號。

1.2.4 細(xì)胞解離狀態(tài) 6孔板中的細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時，用Papanicolaou′S染色法對各組細(xì)胞進(jìn)行染色，鏡下觀察細(xì)胞解離狀態(tài)。

1.2.5 侵襲能力 Transwell小室分析侵襲能力 Transwell小室（costar，camb ridge，MA，USA）放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，另將含有25.6μg Matrigel的50μL RPMI-1640培養(yǎng)基加到上層小室的微孔濾膜上（直徑為8μm），37℃放置2h使其形成凝膠狀。各組細(xì)胞用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌后，用吸管吹打懸浮、計(jì)數(shù)、離心。按1×106／mL將細(xì)胞重懸于含0.1%牛血清清蛋白的RPMI-1640培養(yǎng)液中，取100μL細(xì)胞懸液加到小室的基底膜上，小室下層加800μL含0.1%牛血清清蛋白的RPM I-1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)20h。取出小室，吸棄小室內(nèi)的培養(yǎng)液，并用棉簽仔細(xì)拭出小室內(nèi)的細(xì)胞和人工基底膜，進(jìn)行Diff-Quik染色。顯微鏡下觀察侵襲移動到多孔濾膜外側(cè)面上的細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，利用非配對Student′st檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR 轉(zhuǎn)染48h后，siRNA組的mRNA表達(dá)水平顯著降低，與陰性對照組相比下降了84.37%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 TJP-2siRNA轉(zhuǎn)染后的mRNA結(jié)果

2.2 Westernblot 結(jié)果顯示Tjp-2蛋白表達(dá)在對照組和陰性對照組胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，而在轉(zhuǎn)染組胰腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，與陰性對照組比較下降了92.32%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 TJP-2siRNA轉(zhuǎn)染后的蛋白表達(dá)結(jié)果

2.3 細(xì)胞解離狀態(tài) Papanicolaou′S染色，鏡下觀察細(xì)胞解離狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)對照組及陰性對照組胰腺癌細(xì)胞PC-1均呈島樣克隆細(xì)胞生長，對照組及陰性對照組每個視野解離細(xì)胞數(shù)分別為

2個、2個，而siRNA轉(zhuǎn)染后48h每個視野的細(xì)胞解離狀態(tài)發(fā)生變化開始呈散在單個細(xì)胞生長，轉(zhuǎn)染組為每個視野6個解離細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后解離細(xì)胞數(shù)明顯增多，見圖3。

圖3 各組胰腺癌細(xì)胞的解離狀態(tài)

圖4 胰腺癌侵襲能力比較

2.4 Transwell小室方法分析侵襲能力 將細(xì)胞加入含Matrigel的Transwell上室培養(yǎng)24h，Diff-Quik染色后鏡下觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)隨機(jī)5個視野（×200）內(nèi)細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)對照組、陰性對照侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（20.2±2.59）、（19.6±1.14）個，而轉(zhuǎn)染 TJP-2siRNA后為（37.4±1.14）個，侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖4。

表1 各組胰腺癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)比較（n）

3 討 論

近年來，隨著對胰腺癌發(fā)生的分子機(jī)制研究的不斷深入，分子靶向治療成為研究的熱點(diǎn)。新生的靶向藥物由于成功治療了慢性白血病和乳腺癌、結(jié)腸癌，點(diǎn)燃了胰腺癌治療的新希望。為改善胰腺癌預(yù)后，針對胰腺癌高度的侵襲轉(zhuǎn)移特性，開發(fā)抑制胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的新型靶向治療藥物是當(dāng)務(wù)之急。通過抑制胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移，使腫瘤限定于局部，再配合手術(shù)切除局部腫瘤，可能是根治胰腺癌值得探索的一條新途徑。最近，緊密連接在細(xì)胞生物學(xué)方面的進(jìn)展 ，揭示了緊密連接的屏障功能和防御功能，表明以緊密連接蛋白作為藥物開發(fā)的靶標(biāo)有著廣闊的前景。

與緊密連接相關(guān)的幾個胞質(zhì)蛋白中，ZO-1、Tjp-2最具特征性。1986年通過用緊密連接片段免疫鼠肝細(xì)胞形成的特異性單克隆抗體鑒定了ZO-1。ZO-1在緊密連接、腎小球表皮細(xì)胞過濾孔和一些鈣粘素連接中均有發(fā)現(xiàn)。由于ZO-1，Tjp-2的多種異構(gòu)體形式的存在不同細(xì)胞類型的緊密連接意義不同。ZO-1和Tjp-2之間相互作用，ZO-1結(jié)合于Occludin的羧基端（－COOH）。ZO-1和Tjp-2均屬于膜連接MAGUK家族。此蛋白質(zhì)家族成員多數(shù)位于細(xì)胞之間的連接處并且與細(xì)胞骨架通過胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用，Tjp-2可能與MEK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)［7］。近來研究表明ZO-1與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)［8］，ZO-2是急性白血病的致癌因子［9］。有研究表明 ZO可能與血瘤屏障有關(guān)［10］，ZO-1在黏膜屏障中具有重要作用［11］。而研究表明 Tjp-2在胰腺癌和乳腺癌中表達(dá)失調(diào)［12］。

本研究表明，轉(zhuǎn)染前后光鏡下細(xì)胞的解離狀態(tài)也有差異，轉(zhuǎn)染處理后的PC-1細(xì)胞Tjp-2表達(dá)明顯降低，胰腺癌細(xì)胞的解離狀態(tài)也相應(yīng)改變，從原來的島樣克隆式生長變?yōu)閱蝹€散在方式生長。證明Tjp-2表達(dá)與倉鼠的胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞解離狀態(tài)密切相關(guān)。當(dāng)siRNA轉(zhuǎn)染處理PC-1后，在細(xì)胞膜細(xì)胞間連接處的Tjp-2表達(dá)明顯減弱，從而導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞解離，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明其侵襲能力相應(yīng)增強(qiáng)。所以，在倉鼠的胰腺癌細(xì)胞中Tjp-2的表達(dá)變化與胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，且成負(fù)相關(guān)，基因沉默Tjp-2后胰腺癌細(xì)胞開始解離且侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。且有研究證明Tjp-2蛋白可被磷酸化，Tjp-2磷酸化狀態(tài)的改變可能調(diào)控其細(xì)胞內(nèi)定位［13－15］。所以筆者推測Tjp-2的磷酸化狀態(tài)變化可通過MEK／ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)控，Tjp-2磷酸化在胰腺癌調(diào)控機(jī)制中的作用需進(jìn)一步更深入的研究。

綜上所述，通過siRNA轉(zhuǎn)染PC-1細(xì)胞后對Tjp-2表達(dá)和細(xì)胞解離、侵襲能力的研究證明Tjp-2的表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞解離狀態(tài)密切相關(guān)，并且可以調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。Tjp-2作為胰腺癌重要的腫瘤標(biāo)記物，為開發(fā)新的抗胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子靶向治療方法提供了重要的理論依據(jù)。

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