Survivin反義核苷酸對(duì)宣威肺腺癌移植瘤裸鼠模型作用的研究＊

王巍煒，洪志鵬，李高峰△，王紹佳，陳瑞彬，張繼朋

（1.昆明醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院胸外科／云南省腫瘤醫(yī)院肺癌研究中心 650118；2.昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科 650032；3.昆明醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦科腫瘤科 650118）

宣威地區(qū)一直是西南、乃至全國(guó)的肺癌高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率和病死率一直高居不下，肺癌防控面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。前期研究發(fā)現(xiàn)宣威地區(qū)肺腺癌患者中survivin高表達(dá)，研究人員利用survivin反義核苷酸（ASODN）抑制宣威肺腺癌細(xì)胞取得了較好的效果［1－2］。在前期研究基礎(chǔ)上本研究采用體外培養(yǎng)宣威肺腺癌細(xì)胞XWLC-05細(xì)胞皮下接種法，在裸鼠體內(nèi)建立皮下宣威肺腺癌細(xì)胞XWLC-05細(xì)胞移植瘤模型。通過(guò)皮下移植瘤內(nèi)多點(diǎn)注射，觀察survivinASODN對(duì)肺癌移植瘤生長(zhǎng)影響的情況，為下一步臨床研究提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 survivinASODN的合成和主要試劑 參照文獻(xiàn)［3］針對(duì)位于survivinmRNA 232～251bp處的序列，合成ASODN：5′-CCC AGC CTT CCA GCT CCT TG-3′和 正 義 寡 核 苷 酸（SODN）：5′-CAA GGA GCT GGA AGG CTG GG-3′。序列兩端堿基經(jīng)硫代修飾對(duì)抗核酸酶的降解，經(jīng)計(jì)算機(jī)網(wǎng)上檢索證實(shí)與survivin以外的己知人類基因無(wú)同源性。序列由上海生物

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)均以±s表示。各組間比較應(yīng)用方差分析最小顯著差法（F檢驗(yàn)，α＝0.05），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組裸鼠一般情況 整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間4組裸鼠未出現(xiàn)死亡，大、小便及飲食情況正常，活動(dòng)度等未出現(xiàn)其他明顯的異常情況。處死后對(duì)各組裸鼠心臟、肝臟、腎臟進(jìn)行病理檢查均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯變性壞死表現(xiàn)。

2.2 裸鼠腫瘤的體積及生長(zhǎng)指數(shù)變化情況 survivinASODN治療組其腫瘤生長(zhǎng)速度較為緩慢，其中部分裸鼠表現(xiàn)為腫瘤停止生長(zhǎng)，甚至其中3只出現(xiàn)腫瘤退縮消失。治療結(jié)束后survivinASODN注射組瘤體的腫瘤大小明顯低于其他3組，而其他3組相似。survivinASODN治療組腫瘤生長(zhǎng)指數(shù)為（2.78±0.27），遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組（5.71±0.31）、LIP組（6.21±0.23）和survivinSODN組（5.69±0.37），見(jiàn)圖1。

2.3 裸鼠腫瘤的質(zhì)量變化及抑瘤率情況 末次survivinASODN注射后第2周以脫臼法斷頸處死所有荷瘤裸鼠，提取腫瘤并且稱取質(zhì)量?？梢园l(fā)現(xiàn)survivinASODN注射組瘤體的腫瘤質(zhì)量為（1.06±0.04）g，低于對(duì)照組（2.22±0.03）g、LIP組工程公司幫助合成。細(xì)胞培養(yǎng)采用RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibeo公司）；新生小牛血清采用杭州四季青生物公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 選取云南宣威肺腺癌細(xì)胞株XWLC-05，由昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心提供。將其于－80℃冰箱中將保存后取出、后培養(yǎng)、傳代，最后將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 移植瘤裸鼠模型的建立 4～6周齡BALB／C裸小鼠，體質(zhì)量18～22g，雌、雄均可，購(gòu)于昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于SPF級(jí)無(wú)菌飼養(yǎng)室，自由攝取食物和水。采用培養(yǎng)細(xì)胞皮下接種移植法。對(duì)XWLC-05細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)1個(gè)月左右，于接種當(dāng)日收集大量的培養(yǎng)細(xì)胞后，立即接種，接種細(xì)胞數(shù)量為2.0×106（約0.5mL懸液），用1mL注射器將單細(xì)胞懸液注射于裸鼠左前腋?jìng)?cè)皮下。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及survivinASODN注射 將一批實(shí)驗(yàn)用裸鼠接種后至腫瘤最長(zhǎng)徑達(dá)8～10mm時(shí)，隨機(jī)挑選其中48只，隨機(jī)分4組，每組12只。對(duì)照組：予生理鹽水處理；單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（LIP）組：予等量的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染液處理；survivinSODN組：予600nmol／L survivinSODN 脂質(zhì)體復(fù)合物處理；survivinASODN組：予600nmol／L survivinASODN脂質(zhì)體復(fù)合物處理。各組分別于成瘤分組后每隔48h按直接移植瘤內(nèi)多點(diǎn)注射1次，共注射5次。

1.5 XWLC-05裸小鼠皮下移植瘤體積、質(zhì)量及腫瘤生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定 分別于每次注射前用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)徑和最短徑，并稱體質(zhì)量。于末次survivinASODN注射后第2周以脫臼法斷頸處死所有荷瘤裸鼠，取移植瘤測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)徑（a）和最短徑（b），按公式v＝ab2／2計(jì)算腫瘤體積，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)指數(shù)：（V治療后－V治療前）／V治療前。稱取瘤結(jié)節(jié)質(zhì)量，以瘤結(jié)節(jié)質(zhì)量計(jì)算抑瘤率：抑瘤率（%）＝（對(duì)照組質(zhì)量－實(shí)驗(yàn)組質(zhì)量）／對(duì)照組質(zhì)量×100%。

1.6 一般狀況觀察及組織學(xué)檢查 觀察包括裸鼠的飲食、大小便、精神狀況等。處死裸鼠后標(biāo)本固定后，留取心臟、肝臟、腎臟和腫瘤組織用4%多聚甲醛固定后在光鏡下觀察腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡、炎癥反應(yīng)等改變。（2.61±0.04）g和survivinSODN 組（2.69±0.05）g，survivin ASODN抑瘤率為（37.26±1.92）%，見(jiàn)圖2。

圖1 survivinASODN轉(zhuǎn)染對(duì)裸鼠移植瘤腫瘤生長(zhǎng)指數(shù)的影響

圖2 survivinASODN轉(zhuǎn)染對(duì)裸鼠移植瘤腫瘤質(zhì)量的影響

2.4 survivinASODN轉(zhuǎn)染對(duì)裸鼠腫瘤組織的影響 對(duì)照組、LIP組和survivinSODN組細(xì)胞體積大，大小不等，胞漿豐富，胞核大，深染，核分裂相多見(jiàn)，偶見(jiàn)瘤巨細(xì)胞。而survivinASODN處理組XWLC-05細(xì)胞形態(tài)與其他3組相似，但瘤組織中有大量的細(xì)胞壞死灶，結(jié)締組織增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。

3 討 論

survivin基因是在人類基因組文庫(kù)中篩選克隆出IAP家族的一個(gè)新成員，在多種腫瘤中均有表達(dá)［4－5］。前期研究表明，和其他腫瘤細(xì)胞中情況相似［6－7］，通過(guò)對(duì)特定靶向基因的survivin的反義抑制，可以影響其基因、蛋白的表達(dá)，可抑制宣威肺腺癌細(xì)胞XWLC-05增殖并誘發(fā)其凋亡，從而抑制其生長(zhǎng)［8］。本研究采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)一步研究survivinASODN對(duì)小鼠宣威肺腺癌轉(zhuǎn)移瘤的干預(yù)作用。采用反義技術(shù)，針對(duì)survivin基因232～251bp處的序列，合成反義寡核苷酸，并且采用脂質(zhì)體包裹、硫代磷酸修飾后將其直接多點(diǎn)注射于宣威肺腺癌細(xì)胞XWLC-05裸鼠皮下移植瘤內(nèi)。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)survivinASODN組的腫瘤生長(zhǎng)比較緩慢，其中部分裸鼠表現(xiàn)為腫瘤生長(zhǎng)緩慢或者停止生長(zhǎng)，甚至其中3只裸鼠出現(xiàn)腫瘤退縮消失。測(cè)量結(jié)果也顯示survivinASODN組瘤體生長(zhǎng)指數(shù)（2.78±0.27）低于與對(duì)照組、LIP組和survivnSODN組。處死所有荷瘤裸鼠稱取其腫瘤質(zhì)量。可以發(fā)現(xiàn)survivinASODN注射組瘤體的腫瘤質(zhì)量為（1.06±0.04）g，低于其他3組，其抑瘤率高達(dá)（37.26±1.92）%。顯微鏡下觀察顯示，ASODN組液化壞死灶增多，凋亡細(xì)胞增加。提示，survivinASODN對(duì)宣威肺腺癌細(xì)胞XWLC-05裸鼠移植瘤產(chǎn)生了明顯的抑制作用，結(jié)合相關(guān)研究和本研究結(jié)果推測(cè)可能是由于survivinASODN干擾survivin的表達(dá)或抑制其功能的發(fā)揮，從而抑制有絲分裂并促進(jìn)自發(fā)細(xì)胞凋亡，使腫瘤生長(zhǎng)速度延緩，瘤體質(zhì)量減輕［9－10］。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中4組裸鼠均沒(méi)有出現(xiàn)死亡，大小便及飲食情況沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯異常，處死后各組裸鼠心臟、肝臟、腎臟均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯變性、壞死表現(xiàn)。提示脂質(zhì)體、反義核酸對(duì)于裸鼠是安全的，這可能由于survivin僅特異性地表達(dá)于腫瘤組織［11－12］，而survivinASODN治療具有良好的靶向性、特異性，其對(duì)正常組織影響較小。

survivinASODN處理宣威肺腺癌細(xì)胞裸鼠肺癌細(xì)胞XWLC-05移植瘤后，腫瘤的生長(zhǎng)明顯受到抑制，未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，提示在宣威肺腺癌中采用反義核苷酸治療是安全、可行的［13－15］，為下一步臨床治療提供了思路和實(shí)驗(yàn)室資料。

［1］ Wang WW，Li GF，Hong ZP.The effect of the exression of Survivin antioligonucleotide on the apoptosis of Xuanwei lung adenocarinome cell［J］.Chinese-German Journal of Clinical Oncoloy，2011，10（5）：252-255.

［2］ 王巍煒，李高峰，洪志鵬，等.宣威昆明兩地區(qū)肺腺癌中survivin表達(dá)的比較研究［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2010，39（7）：61-62.

［3］ 1saka T，Maruno M，Nakata H，et al.Effeetiveness of spray application of ACNU in the local of malignant gliomas：report of two case［J］.Neurol Res，2002，22（2）：181-184.

［4］ 鄧開，王洪林.survivin基因在腫瘤中的研究進(jìn)展［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2008，37（10）：1111-1113.

［5］ 劉敏，李萍，蘭顯國(guó)，等.Survivin和VEGF在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)及臨床意義［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2010，39（10）：1231-1232.

［6］Semenza GL.Regulation of Oxygen Homeostasis by Hypoxia-Inducible Factor 1［J］.Physiology，2009，24（2）：97-106.

［7］ 李玉華，宮向前，邢建華，等.Survivin反義核酸對(duì)大腸癌HT229細(xì)胞化療的影響［J］.中華腫瘤防治雜志，2006，13（21）：1620-1622.

［8］ Shen C，Duck A，Polat B，et al.Triplex forming cligodeoxy-nucleotides targeting Survivin inhibitor proliferation and induce apoptosis of human lung carcinomar cells［J］.Cancer Gene Ther，2003，10（5）：403-410.

［9］ 王志成，王海霞，郭德玉，等.survivin反義核酸抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2008，37（22）：2570-2574.

［10］Shen C，Duck A，Polat B，et al.Triplex forming cligodeoxy-nucleotides targeting Survivin inhibitor proliferation and induce apoptosis of human lung carcinomar cells［J］.Cancer Gene Ther，2003，10（5）：403-410.

［11］Tanaka K，Iwamoto S，Gon G，et al.Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas［J］.Clin CancerRes，2000，6（1）：127.

［12］Falleni M，Pellegrinii C，Marchetti A，et al.Survivin gene ex-pression in early stage non small cell lung cancer［J］.J Pathol，2003，200（5）：620-626.

［13］Lehner R，Bobak J，Kim NW，et al.Localization of telomerasehtert protein and Survivin in placenta：relation to placental development and hydatidiform mole［J］.Obstet Gynecol，2001，97（6）：965-970.

［14］孫頂，蔡建明，祝寶讓，等.STAT3反義寡核苷酸對(duì)人肺腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（1）：76-79.

［15］Sah NK，Khan Z，Khan GJ，et al.Structural functional and therapeutic biology of Survivin［J］.Cancer Lett，2006，244（2）：164-171.