阿托伐他汀對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Lox-1、TNF-α及ICAM-1表達(dá)的影響＊

姜玉姬，姜 華

（延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，吉林延吉 133000）

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）以血管壁內(nèi)脂質(zhì)、炎癥細(xì)胞聚集為特征［1］。研究表明炎癥因子如腫瘤壞死因子－α（TNF-α）及細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）在AS的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用，同時(shí)脂多糖（LPS）通過(guò)激活TLR 4／NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)上調(diào)血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）的表達(dá)，從而增加氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，最終加速AS的進(jìn)程［2］。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用LPS刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)TLR4／NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，從而激活下游LOX-1、TNF-α 及 ICAM-1 等 炎 癥 因 子，并 用 阿 托 伐 他 ?。ˋTV）進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)LOX-1、TNF-α及ICAM-1表達(dá)的影響，探討ATV的抗炎及防治AS的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物研究所；第Ⅷ因子相關(guān)抗原購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品；RNAOUT總RNA提取試劑盒、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒和LOX-1、ICAM-1及 TNF-α單克隆抗體和二抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 參考人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法［3］，取健康嬰兒新鮮臍帶，在無(wú)菌條件下，用胰蛋白酶消化法分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞并靜止培養(yǎng)，用第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光染色鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)時(shí)采用第2～5代細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合成單層后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組及干預(yù) 用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞18h，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合成單層后，隨機(jī)分為3組：即空白對(duì)照組、模型組、ATV（ATV）組，各組分別用下列方法進(jìn)行干預(yù)，（1）空白對(duì)照組：僅含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液；（2）模型組：含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)液＋LPS（1μg／mL）；（3）ATV組：含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液＋ LPS（1μg／mL）＋ATV（10μmol／L）。培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。

1.2.3 熒光定量PCR 用RNA-OUT提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用熒光定量PCR方法測(cè)定mRNA的表達(dá)。擴(kuò)增條件：94℃變性5min（94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min）×55個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。本實(shí)驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參照。引物由大連寶生物工程有限公司合成。LOX-1上游引物：5′-ATC CAT CAT CCC TCA AC-3′，下 游 引物：5′-GAA

AGA AGC CAG ACA AA-3′，擴(kuò)增片段為142bp；TNF-α上游引物：5′-CCA TGT CTT TCT ACC CTA ATC-3′，下游引物：5′-AGC TGC TCT GTC GGA TGA GCA-3′，擴(kuò)增片段為157 bp；ICAM-1上游引物：5′-GTA GCA GCA GCA GTC ATA-3′；下游引物：5′-CGG GAT AGT TTC AGG GAG-3′，擴(kuò)增片段為151bp。GAPDH上游引物：5′-CTC ATG ACC ACA GTC CAT AGC-3′，下 游 引 物：5′-CAC ATT GGG GGT AGG AAC GAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為211bp。用2－△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 Western blot 收集人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，收集蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。每條泳道以60μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜。加入1∶200的兔抗人LOX-1、TNF-α及ICAM-1一抗稀釋液，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，再加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗稀釋液（1∶1 000），置室溫2h顯色，使用光密度分析軟件處理分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

結(jié)果見(jiàn)表1、2和圖1～3。

表1 ATV對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1、TNF-α及ICAM-1mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝5）

表1 ATV對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1、TNF-α及ICAM-1mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝5）

＊：P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；△：P＜0.01，與模型組比較。

組別 LOX-1 TNF-α 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 2.94±0.48＊ 3.26±0.52＊ 2.91±0.54＊ATV組 1.58±0.27△ 1.78±0.43△ 1.65±0.26 ICAM-1空白對(duì)照組△

表2 ATV對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1、TNF-α及ICAM-1蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）

表2 ATV對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1、TNF-α及ICAM-1蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）

＊：P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；△：P＜0.01，與模型組比較。

組別 LOX-1 TNF-α 0.259±0.014 0.471±0.026 0.253±0.027模型組 0.726±0.048＊ 0.971±0.066＊ 0.94±0.023＊ATV組 0.437±0.072△ 0.607±0.034△ 0.415±0.008 ICAM-1空白對(duì)照組△

圖1 LOX-1蛋白表達(dá)

A：為空白對(duì)照組；B：為模型組；C：為ATV組。

圖3 ICAM-1蛋白表達(dá)

3 討 論

在AS的早期，白細(xì)胞和單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移是AS最重要的始動(dòng)環(huán)節(jié)［4］。單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、跨內(nèi)皮遷移、內(nèi)膜巨噬細(xì)胞聚集等多個(gè)環(huán)節(jié)均依賴于黏附分子（如ICAM-1）的作用。ICAM-1能促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，使單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞黏附于內(nèi)皮，然后遷移入內(nèi)皮下，單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，形成泡沫細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)生［5］。黏附分子的表達(dá)同時(shí)受轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的調(diào)節(jié)。研究表明脂多糖可以通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞中的Toll樣受體4激活NF－κB，上調(diào)ICAM-1等黏附分子，參與單核細(xì)胞聚集，啟動(dòng)進(jìn)一步炎癥反應(yīng)。TNF-α是促炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，能直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，這可能也是TNF-α促進(jìn)AS發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)途徑。而且TNF－α還通過(guò)促進(jìn)黏附分子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)白細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及遷移，加速AS的進(jìn)程［6］。ox-LDL作為致AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，經(jīng)LOX-l介導(dǎo)使內(nèi)皮細(xì)胞活化，形成正反饋促進(jìn)脂質(zhì)氧化，誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB的活化，從而引發(fā)促炎因子和黏附分子（如：TNF-α、ICAM-1）的表達(dá)升高［7］；LOX-1本身也可作為內(nèi)皮黏附分子，促進(jìn)ox-LDL和細(xì)胞聚集于血管壁，進(jìn)一步導(dǎo)致斑塊的炎性反應(yīng)，增加斑塊的不穩(wěn)定性［8］。

目前，在AS治療方面，主要以降血脂為主，同時(shí)也用一些抗氧化保護(hù)血管內(nèi)皮、抗血栓形成、抗免疫損傷的藥物。他汀類藥物是調(diào)脂治療的一線藥物，通過(guò)阻斷肝臟羥甲基戊二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸而抑制膽固醇的合成，降低血漿中的低密度脂蛋白。他汀類藥物除有效降低血脂外，還具有抗炎、抗氧化、改善血管內(nèi)皮功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等獨(dú)立于降脂之外的作用。如今他汀類藥物的非降脂效應(yīng)尤其是抗炎作用越來(lái)越受到心血管及其相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜业年P(guān)注，其抗炎效應(yīng)被認(rèn)為在降低心血管事件發(fā)生率上也扮演著極為重要的角色，而且該效應(yīng)可能獨(dú)立于其降脂效應(yīng)［9］。

本研究結(jié)果表明，用LPS刺激24h后，LOX-1、TNF-α及ICAM-1基因和蛋白表達(dá)明顯升高，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其可能機(jī)制是LPS通過(guò)TLR4／NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活下游LOX-1、TNF-α及ICAM-1。用ATV干預(yù)之后，LOX-1、TNF-α及ICAM-1的基因及蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明ATV對(duì)LOX-1、TNF-α及ICAM-1有明顯的抑制作用。通過(guò)抑制LOX-1、TNF-α及ICAM-1的表達(dá)，ATV 可減少單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附以及內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而達(dá)到抗AS的作用。這可能是其抗AS的作用機(jī)制之一。

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