RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化在胃癌階段性發(fā)生及進展中的作用及臨床意義＊

滕 玥，戴冬秋，沈文靜，劉紅波

（1.中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院急診科，沈陽 110840；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬

第四醫(yī)院胃腸外科，沈陽 110001；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽 110001；4.中國醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室，沈陽 110001）

胃癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，國內(nèi)外大量研究顯示，表遺傳學(xué)機制在胃癌的發(fā)生及進展中起重要作用［1－3］。腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG）功能喪失可通過多種途徑，現(xiàn)已證實DNA甲基化是基因突變及缺失之外TSG失活的第3種機制，而且在某些情況下是其失活的惟一機制［4］。Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族基因1A（ras associated domain family gene 1A，RASSF1A）是已經(jīng)確認的抑癌基因，與細胞周期調(diào)控、微管的穩(wěn)定性、細胞的黏附和運動性以及細胞凋亡相關(guān)，可以通過多種途徑抑制細胞生長、促進細胞凋亡和衰老［5－8］。有研究表明，RASSF1A基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化可以引起表達缺失，進而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，這在胃癌中已有報道［9－10］。但是，RASSF1A基因啟動子區(qū)CpG甲基化在胃癌階段性發(fā)生及進展中的作用有待探討。本研究通過檢測癌旁距離胃癌原發(fā)灶不同距離組織及胃癌原發(fā)癌灶本身RASSF1A基因異常甲基化的差異，結(jié)合病理學(xué)角度分析，探討RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化在胃癌階段性發(fā)生及進展中的作用，為胃癌浸潤擴散范圍的評估提供新的分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2006年1月～8月在中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所手術(shù)治療胃癌患者40例，每例患者分別采取距胃癌原發(fā)灶邊緣5、3、1cm組織及胃癌原發(fā)灶組織。標(biāo)本取材兩份，一份液氮中速凍后放入－70℃冰箱凍存，另一份用甲醛固定、石蠟包埋后保存。40例患者，其中男30例，女10例，男女比例為3∶1；年齡最大者78歲，最小者29歲，平均（61.5±11.7）歲。病例按UICC新TNM分期標(biāo)準(zhǔn)、日本胃癌處理規(guī)約及中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所胃癌外科分型進行分期、分型，術(shù)后經(jīng)病理診斷證實，術(shù)前均未經(jīng)放療及化療。組織病理學(xué)檢查：將40例胃癌患者術(shù)后距離癌灶邊緣5、3、1cm處及胃癌原發(fā)灶取材的160枚組織塊標(biāo)本制作為石蠟切片，由2位病理醫(yī)師按UICC新TNM分期標(biāo)準(zhǔn)、日本胃癌處理規(guī)約及中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所胃癌外科分型標(biāo)準(zhǔn)讀片報告。

1.2 甲基化特異性PCR 組織DNA提?。撼Ｒ?guī)酚－氯仿－異戊醇法提取組織DNA，紫外分光光度法檢測DNA濃度和純度。DNA修飾及純化：氰醌（hydroquinone）和亞硫酸氫鈉（sodium bisulfite）購自 Sigma公司；DNA Clean-up System 購自 Promega公司。按文獻方法進行DNA修飾及純化［11］。甲基化特異PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系25μL，包括樣品DNA 2μL，10×PCR緩沖液2.5μL，引物各0.5μL，dNTP 2μL，Taq酶0.2μL，雙蒸水17.3μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃ 退火45s，72℃延伸30s，40個循環(huán)；72℃延伸10min，退火溫度依據(jù)不同基因而定。以甲基轉(zhuǎn)移酶SssⅠ處理和未處理的健康人外周血細胞DNA作為陽性對照和陰性對照，以雙蒸水作為空白對照。1 000bp DL2000作為相對分子質(zhì)量標(biāo)記。引物序列，甲基化引物：上游引物5′-GTG TTA ACG CGT TGC GTA TC -3′，下 游 引 物 5′-AAC CCC GCG AAC TAA AAA CGA-3′，擴增產(chǎn)物94bp；非甲基化引物：上游引物5′-TTT GGT TGG AGT GTG TTA ATG TG -3′，下游引物5′-CAA ACC CCA CAA ACT AAA AAC AA -3′，擴增產(chǎn)物108bp。電泳：取PCR產(chǎn)物5μL，應(yīng)用2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100V，電泳時間40min，結(jié)果經(jīng)激光密度掃描儀（Pharmacia LKB Ultroscan）照相進行分析。

1.3 結(jié)果判斷 （1）甲基化：甲基化特異引物（M）擴增出目的條帶，而非甲基化特異引物（U）無條帶擴出；（2）非甲基化：非甲基化特異性引物（U）擴增出目的條帶，而甲基化引物（M）無條帶擴出；（3）半甲基化：兩對引物均擴增出目的條帶，統(tǒng)計分析結(jié)果時將甲基化與半甲基化均計為甲基化陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析。各組甲基化頻率進行比較采用χ2檢驗和Fisher精確概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌癌旁不同距離組織及原發(fā)癌灶中RASSF1A基因甲基化差異 在距胃癌原發(fā)灶邊緣5、3、1cm組織及原發(fā)灶中的RASSF1A基因甲基化陽性率分別為5.0%、7.5%、22.5%及42.5%，在距原發(fā)灶邊緣5、3cm組織的陽性率均顯著低于原發(fā)灶中（χ2＝15.53，P＜0.05；χ2＝13.06，P＜0.05）；距原發(fā)灶邊緣1cm組織的RASSF1A基因甲基化陽性率為低于原發(fā)灶中陽性率，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝3.05，P＝0.056）。距原發(fā)灶邊緣5cm組織中陽性率顯著低于原發(fā)灶邊緣1cm組織中（χ2＝5.16，P＝0.023）；距原發(fā)灶邊緣3cm組織中陽性率低于距原發(fā)灶邊緣1cm組織的陽性率，但差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。由距原發(fā)灶邊緣5、3、1cm組織至胃癌原發(fā)灶，隨距癌灶邊緣距離的減少，RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化陽性率呈增高趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝22.85，P＜0.01）。見圖1、表1。

圖1 不同胃組織RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化檢測圖

表1 距胃癌原發(fā)灶邊緣5、3、1cm組織及原發(fā)癌灶中RASSF1A基因甲基化的差異

2.2 胃癌癌灶旁正常胃組織、癌前病變組織及胃癌原發(fā)灶中RASSF1A基因甲基化差異 對實驗所取標(biāo)本進行組織病理學(xué)檢查，40例胃癌癌旁5cm取材標(biāo)本中正常胃組織24例，距胃癌原發(fā)灶邊緣5、3、1cm組織中癌前病變類型組織（如慢性胃炎及萎縮性胃炎等）23例。以距胃癌原發(fā)灶邊緣5cm病理檢測的24例正常胃組織作為胃正常組織組，以病理檢測確定的癌前病變組織（如慢性胃炎及萎縮性胃炎等）23例作為癌前病變組，以胃癌原發(fā)癌灶40例作為胃癌組，3組RASSF1A基因甲基化陽性率分別為0%、17.39%、42.5%，正常胃組織組RASSF1A基因甲基化顯著低于癌前病變組及胃癌組（χ2＝4.56，P＜0.05；χ2＝13.39，P＜0.05），癌前病變組 RASSF1A基因甲基化顯著低于胃癌組（χ2＝4.14，P＜0.05）。3組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

2.3 RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化與胃癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 見表3。

表2 病理確定的胃正常組織、胃癌癌前病變組織及胃癌原發(fā)灶中RASSF1A基因甲基化差異

表3 胃癌原發(fā)灶RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化與臨床病理因素的關(guān)系

3 討 論

胃癌的發(fā)生是表遺傳學(xué)和遺傳學(xué)兩大類機制共同作用的過程［1］，DNA甲基化是表遺傳學(xué)機制最常見的形式，基因啟動子區(qū)異常甲基化可抑制基因表達而使其功能喪失，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，DNA異常甲基化與胃癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，RASSF1A基因啟動子區(qū)異常甲基化可以引起表達缺失，進而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，這在包括乳腺癌和肺癌在內(nèi)的多種人類腫瘤中已被證實［12－13］，RASSF1A基因啟動子區(qū)異常甲基化與胃癌的發(fā)生相關(guān)［9－10］，在胃癌原發(fā)灶組織、正常組織、轉(zhuǎn)移灶組織及癌前病變組織中啟動子區(qū)CpG島異常甲基化已有報道。但是，正常胃組織以及與距胃癌原發(fā)灶邊緣不同距離的胃組織中RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及與胃癌癌灶之間距離的關(guān)系還沒有相關(guān)報道。

本研究從胃癌患者距癌灶邊緣不同距離組織及與胃癌原發(fā)癌灶進行比較的角度分析了RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化情況。結(jié)果顯示，隨著從癌旁組織到胃癌癌灶距離的減少，RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化陽性率呈現(xiàn)上升趨勢，且不同距離組織中RASSF1A基因甲基化陽性率差異顯著，表明RASSF1A基因甲基化從距癌灶邊緣5、3、1cm組織至胃癌癌灶中呈現(xiàn)逐漸升高的動態(tài)變化，這種變化趨勢與胃癌患者從癌旁組織到癌灶本身臨床病變變化趨勢相一致，距胃癌癌灶越近的組織中異常甲基化率越高，并且在胃癌癌灶中呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，這說明RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，參與了胃癌的階段性發(fā)生。Byun等［9］與Ye等［10］的研究表明RASSF1A基因啟動子區(qū)異常甲基化及導(dǎo)致的表達下降與胃癌的發(fā)生相關(guān)。

在組織病理學(xué)檢查的基礎(chǔ)上，本研究系統(tǒng)分析了正常胃組織、癌旁慢性胃炎、萎縮性胃炎等胃癌前病變組織及胃癌組織中RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化率的差異。結(jié)果顯示，RASSF1A基因甲基化率在正常胃組織、癌旁胃癌前病變及胃癌組織3者之間差異顯著，進一步說明了RASSF1A基因的異常甲基化參與了由正常胃組織發(fā)展為癌前病變組織以及進一步癌變的過程，是胃癌形成和演變過程中的重要事件，表明RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化與胃癌的階段性發(fā)生相關(guān)。本研究顯示，RASSF1A基因在胃癌患者的正常胃組織中呈非甲基化狀態(tài)，在癌灶中呈現(xiàn)腫瘤特異性的甲基化改變，并且在癌前病變階段出現(xiàn)，參與胃癌前病變發(fā)生，提示RASSF1A基因異常甲基化可能用于胃癌早期診斷及臨床篩查。To等［14］的研究RASSF1A基因異常甲基化率在胃癌組織及胃腸型化生組織中分別為25.8%及11.1%，支持RASSF1A基因異常甲基化參與胃癌癌前病變發(fā)生。

本研究進一步分析RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化與胃癌患者臨床生物學(xué)特征的關(guān)系，結(jié)果表明RASSF1A基因甲基化與胃癌患者胃壁浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度相關(guān)，因而可能與胃癌患者的臨床進展及轉(zhuǎn)移相關(guān)。有研究表明RASSF1A可通過降低JNK與c-Jun的磷酸化水平及下調(diào)細胞周期素1阻斷JNK通路，從而抑制腫瘤細胞的生長及浸潤轉(zhuǎn)移［5］。這提示RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化不僅與胃癌的階段性發(fā)生相關(guān)，而且可能與臨床進展相關(guān)。但是，RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化與胃癌患者癌灶的大體類型、生長方式、分化程度、患者的性別及年齡無關(guān)。Byun等［9］分析RASSF1基因在90例早期胃癌中的表達，結(jié)果53.3%的胃癌患者有RASSF1A和（或）RASSF1B表達缺失或降低，且RASSF1A表達缺失或異常降低在進展期胃癌顯著高于早期癌，在低分化癌中比高分化或中分化胃癌中更常見。但是，RASSF1A甲基化改變和胃癌的病理類型及擴散無關(guān)，揭示RASSF1A甲基化改變在胃癌癌變過程中常見，可能促進惡變進程，并可能與胃癌的臨床期別及病理學(xué)分級密切相關(guān)。

本研究與其他研究者胃癌原發(fā)癌灶中RASSF1A基因甲基化陽性率相近［15－16］，但胃癌癌前病變組織中陽性率略高于其他學(xué)者研究結(jié)果?？赡苁菢?biāo)本取材來源不同，其他研究中所取癌前病變組織多是胃鏡下所取單純的胃癌癌前病變組織［14］，RASSF1A基因呈現(xiàn)一定程度的異常甲基化；本研究中所取標(biāo)本為胃癌患者癌灶旁組織，這體現(xiàn)出RASSF1A基因異常甲基化是這些癌前病變組織演變?yōu)榘┑闹匾蛩亍Ｍ瑫r，本研究所取癌前病變組織與胃癌原發(fā)癌灶距離較近，可能受原發(fā)癌灶直接侵襲、淋巴及血行侵襲等因素影響。另外，由于取材胃癌人群地方及種族差異、實驗方法和實驗條件差異也可能影響實驗結(jié)果。

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