BMP-4基因單核苷酸多態(tài)性與腰椎后縱韌帶骨化癥關聯性實驗研究＊

趙偉光，劉振武，劉 利，謝延平，林 欣

（1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院骨一科 056001；2.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院骨科 100050）

后縱韌帶骨化癥（OPLL）是指因后縱韌帶發(fā)生骨化，從而壓迫相應節(jié)段的脊髓和（或）神經根，產生肢體的感覺和運動障礙及內臟植物神經功能紊亂的一種疾病。由于疾病的遲發(fā)特性，保守治療不能阻止本病的發(fā)展，因此，了解OPLL的病因非常必要。據統計，脊柱OPLL 70%發(fā)生于頸椎，胸椎僅占15%，腰椎較少。目前大量研究證實該病與基因多態(tài)性存在明顯相關性［1］，筆者已研究了骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（BMP-4）基因上4個單核苷酸多態(tài)性位點6 007C＞T（rs17563）、－5 826G＞A（rs1957860）、3 564C＞ T （rs2855532）和 IVS-160C ＞ T（rs2071047）與頸椎OPLL的關聯性，證實了其中2個位點與頸椎OPLL的發(fā)生和發(fā)展存在相關性［2］。但在腰椎OPLL患者中是否也存在相似關聯性，目前國內、外尚無有關報道，本研究首次對BMP-4基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、與腰椎OPLL關系進行了研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有入選者皆拍攝腰椎X線平片、CT及采集完整病史，由骨科專家組根據TsuyamaN的診斷標準［3］，將樣本分為腰椎OPLL病例組和對照組。排除與OPLL有關的骨代謝疾病。病例組：男21例，女9例；年齡47～65歲，平均56.7歲；對照組：男19例，女11例；年齡51～70歲，平均60.3歲。收集入選者周圍靜脈血4mL，EDTA-K2抗凝。樣本進行隨機混合編號。

1.2 主要儀器及試劑 Wizard Genomic DNA Purification Kit購自美國Promega公司，dNTP及

耐熱性DNA酶購自日本TaKaRa公司，引物由北京三博遠志生物有限責任公司合成。ABI 3730XL DNA測序儀、PCR儀 MYCYCLER（美國BIORaD公司）、SIGMA低溫高速離心機、凝膠成像系統Biospectrum。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 利用DNA提取試劑盒進行人血白細胞基因組DNA提取。提取的DNA樣品經0.8%瓊脂糖凝膠電泳測定，A260／A280紫外定量，確定每個樣本已提取DNA成功。

1.3.2 聚合酶鏈反應（PCR）及產物序列測定 利用PCR儀，50μL反應體系對目的DNA片段進行體外擴增：10×LA PCR緩沖液5μL＋Mg2＋（25mmol／L）5μL＋dNTPs混合液（25mmol／L）8μL＋上游引物（10μmol／L）1μL＋下游引物（10μmol／L）1μL＋Tap酶（5U／μL）0.5μL＋模板2.5μL，最后加滅菌蒸餾水至50μL。反應條件及引物見表1，相關測序圖見圖1。對產物純化后用直接測序法測定序列。

表1 SNP位點及其引物、擴增片段的長度

圖1 1位腰椎OPLL患者測序圖

1.4 統計學處理 采用SPSS16.0軟件對數據進行統計學處理。用Chi-square test檢驗方法對病例組與對照組4個位點基因型、等位基因型分布進行統計學分析。檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

位點6 007C＞T（rs17563）、3564C＞T（rs2855532）基因型、等位基因型在兩組間的分布差異有統計學意義（P＜0.05），見表2、3。而其余2個位點差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表2 兩組間位點rs17563、rs2855532基因型的分布比較

表3 兩組間位點rs17563、rs2855532等位基因的分布比較

表4 兩組間位點rs2071047、rs1957860基因型的分布比較

3 討 論

OPLL特征是脊柱椎體對應后縱韌帶發(fā)生異位骨化，骨化的韌帶壓迫相應節(jié)段脊髓和（或）神經根出現不同程度的臨床癥狀。OPLL多發(fā)于頸椎，胸、腰椎較少。根據骨化灶的形態(tài)和范圍可分為4型：連續(xù)型、節(jié)段型、混合型和局灶型。Takashid等［4］從病理學方面說明了骨化的后縱韌帶導致脊髓損傷的主要過程：骨化組織對相應節(jié)段脊髓首先產生由前向后的直接壓迫，導致脊髓灰質、白質的壓縮變形，進而引起運動、感覺神經細胞損傷、壞死，側索和后索出現脫髓鞘改變，從而最終可能出現脊髓壞死或軟化。由于這種疾病的遲發(fā)特性，保守治療不能阻止本病的發(fā)展，因此了解OPLL的病因是非常必要的。目前，有關頸椎OPLL發(fā)病機制還不十分清楚，大多數學者認為其發(fā)病與遺傳、脊柱退行性改變、長期反復應力失衡、外傷、先天發(fā)育異常等因素有關。

已有實驗證明OPLL具有強大的遺傳背景，Taizo等［5］進行的一項大樣本病例對照研究（711名OPLL患者和896名對照組）發(fā)現TGF-β3基因的單核苷酸多態(tài)性與OPLL的發(fā)生具有顯著相關性（P＝0.000 40）。Tanno等［6］通過對取自10例OPLL患者與10例對照組后縱韌帶細胞進行的體外單軸循環(huán)拉力誘導實驗證實OPLL組后縱韌帶細胞中的ALP、BMP-4、BMP-2、骨橋蛋白表達均高于對照組，這說明局部應力對該病的發(fā)生也有促進作用。趙剛等［7］對15例腰椎OPLL患者研究，認為腰椎OPLL發(fā)病機制為椎間盤變性后后縱韌帶所受應力增大，局部增生、化生而至骨化，所以腰椎OPLL多為局灶型和節(jié)段型。

基因連鎖分析研究表明調節(jié)骨形成、骨量及其微觀結構的基因定位于染色體14q12-23［8－9］，其中 BMP-4基因位于14q22－23，其除了具有強大的誘導成骨能力外還通過BMP-Smads及MAPK的級聯激活途徑等廣泛參與包括心血管、胃腸、呼吸、泌尿、生殖及神經系統的胚胎發(fā)育、生長和分化［10－12］。Sato等［13］進行的免疫組織化學研究表明，BMP-4、BMP-2在后縱韌帶骨化灶表面肥大化生的軟骨細胞內高表達。筆者已研究了BMP-4基因上4個單核苷酸多態(tài)性位點6 007C＞T（rs17563），－5 826G＞A（rs1957860），3 564C＞T（rs2855532）和IVS-160C＞T（rs2071047）與頸椎 OPPL的關聯性，證實了其中兩個位點與頸椎OPLL的發(fā)生和發(fā)展存在相關性。但在腰椎OPPL患者中是否也存在相似關聯性，目前國內、外尚無報道。腰椎OPPL臨床上較少見，本研究通過多中心才搜集到30例患者，骨化灶全部為局灶型和節(jié)段型，無1例連續(xù)型且多合并鄰近椎間盤突出，這說明局部椎間盤突出可能也參與了腰椎OPLL的發(fā)病過程。

本實驗4個SNP位點6 007C＞T（rs17563）、3 564C＞T（rs2855532）、IVS-160C ＞ T （rs2071047）、－ 5 826G ＞ A（rs1957860）分別位于BMP-4基因外顯子、內含子及轉錄起始點5′端，其中rs17563是惟一位于編碼區(qū)域的SNP位點，已有報道其等位基因C突變?yōu)門從而使產物蛋白質分子152位置上的丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，這種突變可以降低絕經后婦女粗隆間和全髖關節(jié)的骨密度少，基因型之間差異有統計學意義［14］。本實驗也證實了此位點T基因的突變可誘導腰椎OPLL發(fā)病，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），但是否與骨化嚴重程度有關本文未進行研究，因為本研究所搜集的骨化類型較局限易造成偏差。本實驗進一步證實了BMP-4上rs17563、rs2855532基因突變不僅促使頸椎OPPL的發(fā)生而且與腰椎OPLL也有關。但是本研究也有一下幾點局限性：病例數較少；骨化類型較單一，未涉及所有骨化類型。2個位點基因突變是否也可加重骨化程度尚待研究。

最近，一些血清及其他體液中OPPL標志物的研究也可以對OPLL起到早期診斷作用。Ito等［15］通過對脊髓型頸椎病組（n＝35）、OPLL組（n＝7）及對照組（n＝12）腦脊液中IL-8、IL-10、TNF-α含量的比較得出IL-8在前兩組中的含量明顯高于對照組（P＜0.05）。Sugimori等［16］對比了43名 OPLL患者中骨化椎體僅限于頸椎和骨化椎體包括頸、胸、腰椎血清中完整骨鈣素、骨鈣素、Ⅰ型前膠原羧基前肽（procollagen I C-terminal propeptide，PICP）及骨特異性堿性磷酸酶的含量水平，結果顯示前3種蛋白含量頸椎OPLL患者中低于對照組，而骨特異性堿性磷酸酶則未顯示出明顯差異。Ishihara等［17］則報道血清中骨鈣素、PICP、ICTP及尿中丙酮酸含量在OPLL組及對照組中含量未見明顯差異。

腰椎OPPL發(fā)病率較低，但并非臨床上罕見病，由于腰椎肌肉和內部臟器影響普通X線較難發(fā)現骨化灶，所以臨床上推薦對診斷有困難的患者可行三維CT檢查，可準確測量韌帶骨化的厚度及范圍，同時也是制定手術方案的重要參考。

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