轉(zhuǎn)錄因子AP-2α對(duì) HeLa細(xì)胞內(nèi)14-3-3σ表達(dá)的影響＊

甘 露，黃明元，蒙子君，張 哲，羅炳德△

（1.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣州 510515；

2.廣東醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，廣東東莞 523808）

14-3-3σ是14-3-3蛋白家族的一個(gè)成員，它可與多種蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖和死亡調(diào)控及細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)等，在體內(nèi)發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，在腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、演化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究者發(fā)現(xiàn)14-3-3σ在正常皮膚的基底細(xì)胞高表達(dá)，在多種上皮來(lái)源的腫瘤中發(fā)揮了作用［1－2］。14-3-3σ基因受到包括P53在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子的直接調(diào)控，14-3-3σ蛋白反過(guò)來(lái)又能與P53等轉(zhuǎn)錄因子相螯合，影響轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用［3］。但直至目前，14-3-3σ是否與另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白（activator protein-2α，AP-2α）發(fā)生相互作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)轉(zhuǎn)錄因子 AP-2α調(diào)控14-3-3σ的作用進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料 真核表達(dá)載體pCMV-Myc購(gòu)自Clontech公司，pGL3-Basic質(zhì)粒購(gòu)自Promega公司，pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、T4聚合酶購(gòu)自NEB公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，化學(xué)合成的AP-2αsiRNA和siRNA control購(gòu)自上海吉瑪公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人宮頸上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，在含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，相對(duì)濕度95%。細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行消化傳代。細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000試劑盒，按照試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染所用的質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 載體構(gòu)建 為獲得AP-2α過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，AP-2α全長(zhǎng)編碼序列由PCR擴(kuò)增得到，T載體克隆后酶切連入pCMV-Myc真核表達(dá)載體構(gòu)建成 pCMV-Myc／AP-2α，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后表達(dá)Myc／AP-2α。進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因分析試驗(yàn)，以人血液基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到人14-3-3σ基因啟動(dòng)子區(qū)域－1 050～＋299總長(zhǎng)度為1 349bp的片斷，將該片斷經(jīng)XhoⅠ／HindⅢ酶切位點(diǎn)插入pGL3-Basic質(zhì)粒，獲得pGL3／14-3-3σ質(zhì)粒，PCR 引 物 為：5′-CCG CTC GAG TCT GTG AGC CCC GCT GGT AC-3′（sense）和5′-CCC AAG CTT GTA CTC ACG CAC CTC GGG CC-3′（antisense）。

1.4 熒光定量RT-PCR HeLa細(xì)胞接種在6孔板，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48h收集細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，按Promega的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)條件為95℃5min；95℃預(yù)變性15s，60℃退火15s，72℃延伸32s；40個(gè)循環(huán)（最后72℃延伸32s收集熒光信號(hào)）。PCR引物為如下：CAC TGT CCT CCC TTA AAA GCA（AP-2αsense），ATC TGG GCA ACA AAG GAC TA（AP-2αantisense）；GAA CTT TTC CGT CTT CCA CTA C（14-3-3σsense），TCC ACA GTG TCA GGT TGT CT（14-3-3σantisense）；CCT GGA TAC CGC AGC TAG GA（內(nèi)參照18srRNA sense），GCGGCGCAATACGAATGCCCC（內(nèi)參照18srRNA antisense）。

1.5 Western blot HeLa細(xì)胞接種在6孔板，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48h收集細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液（pH7.5的25mmol／L Tris-HCl，137mmol／L NaCl，2.7mmol／L KCl和1%Trixon X-100）充分裂解，離心收集上清液。聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到聚偏氟乙烯（polyvinylidene flroride，PVDF）膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，用 AP-2α和14-3-3σ鼠單克隆抗體（Santa Cruz公司）室溫孵育1h，膜洗3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（武漢博士德）室溫孵育1h，膜洗3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（普利萊基因技術(shù)有限公司）顯影。

1.6 軟件分析14-3-3σ的啟動(dòng)子 應(yīng)用UCSC基因組瀏覽器查找人14-3-3σ基因的啟動(dòng)子序列并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子 AP-2α的結(jié)合位點(diǎn)分析。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因分析試驗(yàn) 用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System （E1910）進(jìn)行樣品熒光素酶活性檢測(cè)，方法：轉(zhuǎn)染前1d，細(xì)胞以1×104／cm2的密度接種于24孔板上，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后加入PBS清洗細(xì)胞，再加入100μL被動(dòng)裂解緩沖液，室溫輕微振搖15min，收集細(xì)胞裂解液。轉(zhuǎn)染48h后加入PBS清洗細(xì)胞，再加入100μL PLB，室溫輕微振搖15min，收集細(xì)胞裂解液。使用手動(dòng)的雙熒光檢測(cè)儀（Promega，GloMax生物發(fā)光檢測(cè)儀）讀值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多組均數(shù)間比較，結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AP-2α對(duì)14-3-3σmRNA 水平的影響 在 HeLa細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染pCMV-Myc／AP-2α過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCMVMyc相比較，AP-2α的 mRNA 水平顯著增高，同時(shí)14-3-3σ的mRNA水平也上升。當(dāng)轉(zhuǎn)染AP-2αsiRNA干擾AP-2α后，與轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA相比，AP-2α的mRNA水平明顯降低，同時(shí)14-3-3σ的mRNA水平也降低，1組和2組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。同時(shí)轉(zhuǎn)染pCMV-Myc／AP-2α過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和 AP-2αsiRNA，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCMV-Myc／AP-2α過(guò)表達(dá)質(zhì)粒相比，結(jié)果顯示AP-2αsiRNA能明顯干擾AP-2α的過(guò)表達(dá)，同時(shí)14-3-3σ的mRNA水平也降低，3組和6組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 AP-2α對(duì)14-3-3σ蛋白水平的影響 在 HeLa細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染pCMV-Myc／AP-2α過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCMVMyc相比較，AP-2α的蛋白水平顯著增高，同時(shí)14-3-3σ的蛋白水平也上升。當(dāng)轉(zhuǎn)染AP-2αsiRNA干擾AP-2α后，與轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA相比，AP-2α的蛋白水平明顯降低，同時(shí)14-3-3σ的蛋白水平也降低。同時(shí)轉(zhuǎn)染pCMV-Myc／AP-2α過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和 AP-2αsiRNA，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCMV-Myc／AP-2α過(guò)表達(dá)質(zhì)粒相比，結(jié)果顯示AP-2αsiRNA能明顯干擾AP-2α的過(guò)表達(dá)，同時(shí)14-3-3σ的蛋白水平也降低，見(jiàn)圖2。

圖1 熒光定量RT-PCR結(jié)果

圖2 Western blot結(jié)果

2.3 人14-3-3σ基因啟動(dòng)子軟件分析結(jié)果 應(yīng)用UCSC基因組瀏覽器查找人14-3-3σ基因的啟動(dòng)子序列并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子AP-2α的結(jié)合位點(diǎn)分析，顯示了人14-3-3σ基因啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游－1 050bp至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游299bp共1 349bp長(zhǎng)度的基因序列。在這1 349bp的啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè)到有10個(gè)AP-2α結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

2.4 AP-2α對(duì)人14-3-3σ基因轉(zhuǎn)錄活性的影響 HeLa細(xì)胞被轉(zhuǎn)染以pGL3-Basic質(zhì)粒時(shí)，檢測(cè)到的熒光素酶活性極低，pGL3-Basic質(zhì)粒與pCMV-Myc／AP-2α質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光素酶活性仍然很低，說(shuō)明AP-2α蛋白的過(guò)表達(dá)對(duì)pGL3-Basic質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性沒(méi)有明顯影響。細(xì)胞被轉(zhuǎn)染以pGL3／14-3-3σ質(zhì)粒后，與對(duì)照組pGL3-Basic組相比較，熒光素酶活性顯著增高（3組和1組），說(shuō)明14-3-3σ啟動(dòng)子在HeLa細(xì)胞中有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性。pGL3／14-3-3σ質(zhì)粒和 pCMV-Myc／AP-2α質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染pGL3／14-3-3σ質(zhì)粒相比較，熒光素酶活性顯著增強(qiáng)，說(shuō)明 AP-2α蛋白可以增強(qiáng)14-3-3σ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，見(jiàn)圖4。

圖3 UCSC基因組瀏覽器在線分析人14-3-3σ基因啟動(dòng)子結(jié)果

圖4 雙熒光素酶報(bào)告基因分析試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

哺乳動(dòng)物的14-3-3蛋白家族至少有7種異構(gòu)體，即β、γ、ε、ζ、η、σ和τ，它們能與磷酸化蛋白相結(jié)合，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞活性，在應(yīng)激反應(yīng)后發(fā)生的細(xì)胞DNA損傷——有絲分裂前期的周期阻滯中發(fā)揮著重要作用［4］。14-3-3家族的成員σ在正常皮膚的基底細(xì)胞高表達(dá)，是上皮類細(xì)胞的標(biāo)志分子［5］；并且已經(jīng)證實(shí)14-3-3σ在多種上皮來(lái)源的腫瘤中發(fā)揮了作用，通過(guò)與CDC2、cyclinB結(jié)合形成復(fù)合物影響細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡［6－8］。

有文獻(xiàn)報(bào)道14-3-3σ基因受到包括P53在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子的直接調(diào)控，14-3-3σ蛋白反過(guò)來(lái)又能與P53等轉(zhuǎn)錄因子相螯合，通過(guò)以下3種可能途徑影響轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用：（1）14-3-3σ蛋白與轉(zhuǎn)錄因子相螯合影響了轉(zhuǎn)錄因子與下游基因的DNA結(jié)合；（2）14-3-3σ蛋白與轉(zhuǎn)錄因子相螯合影響了轉(zhuǎn)錄因子自身的蛋白水解；（3）14-3-3σ蛋白與轉(zhuǎn)錄因子相螯合影響了轉(zhuǎn)錄因子與其他蛋白的相互作用［7，9－10］。但直至目前，14-3-3σ是否與另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子AP-2發(fā)生相互作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

AP-2是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，它參與脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)，病理狀態(tài)下參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。哺乳動(dòng)物 AP-2家族存在5個(gè)亞型：AP-2α、AP-2β、AP-2γ、AP-2δ和 AP-2ε，其中，AP-2α與上皮組織關(guān)系密切，在成年小鼠中，AP-2α的表達(dá)主要集中在皮膚、前列腺、胸腺、眼睛和骨骼肌，AP-2β的表達(dá)主要集中在腎臟，AP-2γ主要在胎盤(pán)表達(dá)。在正常人上皮組織中，AP-2α在基底細(xì)胞層表達(dá)，AP-2γ在基底細(xì)胞、棘細(xì)胞和顆粒細(xì)胞層表達(dá)，而在上皮內(nèi)未檢測(cè)到 AP-2β的表達(dá)［11］。最近 研究 發(fā) 現(xiàn) AP-2與乳腺癌［12，13］、卵巢癌［14］、肺癌［15］、睪丸癌［16］、黑色素瘤［17］等上皮來(lái)源的腫瘤相關(guān)，并通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期與凋亡途徑參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展。以前的研究也證實(shí)，AP-2α能促使宮頸鱗狀上皮癌細(xì)胞系He-La細(xì)胞凋亡［18］。

由于AP-2α與14-3-3σ均在正常上皮組織高表達(dá)，它們?cè)谏掀?lái)源的腫瘤中發(fā)揮了重要作用，因此，AP-2α與14-3-3σ可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中存在密切聯(lián)系。本研究對(duì)AP-2α在宮頸癌細(xì)胞系 HeLa細(xì)胞中調(diào)控14-3-3σ的作用進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn) AP-2α在 HeLa細(xì)胞內(nèi)正調(diào)控14-3-3σ的 mRNA水平和蛋白水平。由于AP-2α是轉(zhuǎn)錄因子，通常是通過(guò)其蛋白的DNA結(jié)合域與下游基因啟動(dòng)子區(qū)域的AP-2結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合來(lái)直接調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，因此，用軟件分析了人14-3-3σ基因的啟動(dòng)子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在人14-3-3σ基因啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游－1 050bp至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游299bp之間，存在10個(gè)潛在的AP-2結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告基因分析試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了AP-2α可以增強(qiáng)14-3-3σ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。

本研究結(jié)果首次證實(shí)了AP-2α正調(diào)控HeLa細(xì)胞內(nèi)14-3-3σ的表達(dá)，并揭示了這種調(diào)控作用可能是通過(guò)AP-2α增強(qiáng)14-3-3σ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)完成的。為深入探討AP-2α調(diào)控14-3-3σ的作用奠定了基礎(chǔ)，為闡明 AP-2α和14-3-3σ在上皮腫瘤中的作用提供了新思路。

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