Anti HER2 ScFv-GFP融合抗體靶向檢測(cè)HER2的表達(dá)

高國(guó)輝，陳翀，楊艷梅，楊涵，王金丹，鄭易，黃奇迪，胡孝渠

1 溫州醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)院 浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035

2 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，浙江 溫州 325035

研究表明，30%左右的乳腺癌、胰腺癌等多種癌癥病人的癌組織細(xì)胞表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子受體-2即HER2[1-4]。盡管HER2在癌細(xì)胞中表達(dá)率不高，但陽(yáng)性的病例大多出現(xiàn)預(yù)后差、發(fā)展快、易早期轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。此外，HER2過(guò)表達(dá)的病例對(duì)多種化療、放療等表現(xiàn)出不敏感。因此，臨床上通過(guò)檢測(cè)癌組織中HER2的表達(dá)來(lái)預(yù)測(cè)癌病人的預(yù)后[5-8]。

目前，檢測(cè)HER2表達(dá)狀態(tài)的方法為3種：免疫組織化學(xué)法 (Immunohistochemistry，IHC)、熒光原位雜交法 (Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH) 和顯色原位雜交法(Chromogenic in situ hybridization，CISH)。免疫組織化學(xué)法將組織經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋及長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存后易導(dǎo)致細(xì)胞膜表面蛋白降解。此外，觀察結(jié)果時(shí)觀察者之間的差異常常導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生誤差[9]。而熒光原位雜交法和顯色原位雜交法均操作繁瑣、耗時(shí)，需要配置專(zhuān)業(yè)的儀器設(shè)備[10-11]。因此，探索一種直觀、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)且無(wú)誤差的快速檢測(cè)方法應(yīng)用于臨床分子實(shí)驗(yàn)診斷HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞十分必要。

本研究為探索攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體在 HER2陽(yáng)性腫瘤的臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值，把綠色熒光蛋白 (GFP) 基因與抗 HER2 ScFv基因拼接，利用pFast Bac HT A/sf9真核表達(dá)系統(tǒng)制備抗HER2 ScFv-GFP融合抗體，分離純化含有綠色熒光的抗HER2單鏈抗體，利用該融合抗體靶向性檢測(cè)兩種已認(rèn)定的乳腺癌HER2陽(yáng)性細(xì)胞BT474、SKBR3，以HER2陰性的MCF7為對(duì)照，比較攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體在HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞檢測(cè)中的功能，同時(shí)，將其應(yīng)用于臨床病理組織靶向檢測(cè)，探索攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體在臨床分子診斷HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞中的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因片段、菌種、載體與細(xì)胞株

桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) pFast Bac HT A/sf9由浙江大學(xué)張傳溪教授提供，鼠源性人抗HER2-ScFv片段由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院宋爾衛(wèi)教授課題組提供，GFP片段由浙江大學(xué)生命科學(xué)院吳敏教授惠贈(zèng)，DH10Bac、TG1等菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存，pGEM T Easy Vector購(gòu)于Promega公司，腫瘤細(xì)胞株BT474、SKBR3、MCF7購(gòu)于上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。乳腺癌臨床病理組織由溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤外科提供。

1.1.2 工具酶及試劑盒

限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ、dNTPs、DNA Marker DL2000、中分子量蛋白Marker、DNA Marker 4500均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、NC膜購(gòu)于Promega公司；鼠抗GFP-Tag mAb、Goat Anti-Mouse IgG-HRP、DAB為Abmart公司產(chǎn)品；GFP標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海物競(jìng)化學(xué)試劑部；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)于Omega公司。

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng)基、抗生素及其他試劑

氨芐青霉素 (Ampicillin) (100 g/L)、卡那霉素 (Kanamycin) (100 g/L)、四環(huán)素 (Tetracyclin) (40 g/L)，慶大霉素 (Genlamycin) 35 g/L為國(guó)產(chǎn)試劑。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、RPMI 1640、胰酶培養(yǎng)液購(gòu)自 GIBCO公司，昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基NTM-FH insect medium為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Anti HER2 ScFv片段序列和GFP序列設(shè)計(jì)引物如表1所示。

Anti HER2 ScFv-R引物中抗HER2-ScFv片段的終止密碼子TAA被刪除掉。

1.2.2 融合基因Anti HER2 ScFv-GFP的構(gòu)建

將Anti HER2 ScFv的PCR產(chǎn)物進(jìn)行EcoRⅠ/ BamHⅠ雙酶切，GFP的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Hind Ⅲ/ BamHⅠ雙酶切，將2條均具有BamHⅠ粘性末端的酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行回收、純化，然后利用T4 DNA連接酶于16 ℃連接14 h左右，以連接產(chǎn)物為模板，以Anti HER2 ScFv-F為Anti HER2ScFv-GFP的上游引物，以 GFP-R為融合基因Anti HER2 ScFv-GFP的下游引物，PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。獲得融合基因，將之克隆到pGEM T Easy載體，EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒后測(cè)序確認(rèn)陽(yáng)性質(zhì)粒中融合基因序列，Blast比對(duì)序列的正確性。

表1 本研究中PCR所用的引物Table 1 PCR primers used in this study

1.2.3 真核表達(dá)載體重組子 pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP的構(gòu)建

用 EcoRⅠ、Hind Ⅲ分別雙酶切 pGEM T Easy Vector/Anti HER2 ScFv-GFP、pFast Bac HT A，用 T4 DNA連接酶將 pFast Bac HT A與Anti HER2 ScFv-GFP在4 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 TG1感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素抗性篩選，雙酶切鑒定重組子，并對(duì)重組子測(cè)序確認(rèn)閱讀框的正確性。

1.2.4 重組Bacmid的獲得與鑒定

將鑒定好的陽(yáng)性重組質(zhì)粒 pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)8 h后，涂布含IPTG、X-gal、卡那霉素、慶大霉素及四環(huán)素的LB平板，篩選白色菌落，在含有上述3種同樣抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，堿裂解法獲得重組病毒DNA，用M13通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò) PCR擴(kuò)增法確定融合基因 Anti HER2 ScFv-GFP是否重組到Bacmid。

1.2.5 昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及重組病毒的感染

在35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種1×106sf9細(xì)胞，加入2 mL有血清培養(yǎng)基，輕搖培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻，27 ℃培養(yǎng)24 h。取兩支1.5 mL離心管分別配制溶液A (約2 μg重組桿狀病毒DNA溶于100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中) 和溶液 B (5 μL Lipoefectin稀釋于80 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中)，合并溶液A和溶液B輕輕混勻，室溫靜置15 min。棄細(xì)胞培養(yǎng)液，并用無(wú)血清培養(yǎng)基洗 3次，加0.8 mL無(wú)血清培養(yǎng)基至Lipoefectin——DNA混合物中，輕輕混勻后，小心滴加到細(xì)胞表面，輕輕混勻。27℃培養(yǎng)8 h后，棄轉(zhuǎn)染液，加有血清培養(yǎng)基2 mL繼續(xù)培養(yǎng)。感染4 d后收集有明顯病毒感染癥狀的細(xì)胞上清，再感染sf9細(xì)胞3輪進(jìn)行病毒擴(kuò)增。熒光顯微鏡下觀察被感染的 sf9的變化。

1.2.6 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化與濃度測(cè)定

取30 mL含有表達(dá)產(chǎn)物的經(jīng)過(guò)第3輪感染的sf9細(xì)胞培養(yǎng)液離心后收集細(xì)胞，用100 mmol/L Tris-HC1 (pH 8.0) 重懸，在昆蟲(chóng)細(xì)胞破碎前按照1∶1 000比例添加胰蛋白酶抑制劑 (Aprotinin)來(lái)防止蛋白酶的降解，冰浴中溫和超聲6次 (每次2 min，間隔10 s) 破碎，4 ℃、10 000×g離心5 min，收集上清，用Ni2+-NTA親合層析柱室溫結(jié)合1 h，用洗滌緩沖液 (100 mmol/L Tris-HC1，20 mmol/L咪唑，pH 8.0) 洗滌5次后，分別用含100、200、500 mmol/L的咪唑洗脫緩沖液洗脫，過(guò)0.45 μm濾膜除菌待用，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定收集的融合蛋白的濃度。

1.2.7 Western blotting分析融合抗體 Anti HER2 ScFv-GFP在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)

純化后的融合抗體樣品經(jīng)SDS-PAGE分析，利用 Bandscan軟件計(jì)算純化的目的蛋白純度，然后電轉(zhuǎn)移至NC膜，以5 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，依次加入鼠抗GFP-Tag mAb (1∶5 000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜) 為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (1∶5 000稀釋?zhuān)覝? h) 為二抗用化學(xué)發(fā)光試劑盒于暗室條件下感光顯影。分析蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。

1.2.8 Western blotting分析三種待測(cè)乳腺癌細(xì)胞株HER2表達(dá)狀態(tài)

取待檢測(cè)的乳腺癌細(xì)胞株SKBR3、BT474，MCF7細(xì)胞培養(yǎng)液各3 mL，離心后收集細(xì)胞，用100 mmol/L Tris-HC1 (pH 8.0) 重懸，冰浴中溫和超聲6次 (每次2 min，間隔10 s) 破碎，4 ℃、10 000×g離心5 min，收集上清，經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至NC膜，以5 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗鼠抗HER2mAb (1∶5 000稀釋)，4 ℃過(guò)夜，以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (1∶5 000稀釋?zhuān)覝? h) 為二抗用化學(xué)發(fā)光試劑盒于暗室條件下感光顯影，分析蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。

1.2.9 融合抗體 Anti HER2 ScFv-GFP不同時(shí)間段檢測(cè)三種乳腺癌細(xì)胞株

胰酶消化生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)的乳腺癌細(xì)胞 SKBR3、BT474和MCF7，重懸于無(wú)胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，1∶5稀釋Anti HER2 ScFv-GFP融合蛋白樣品，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108個(gè)/L，以1 mL/孔加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔 1 mL，設(shè)復(fù)孔為陰性洗脫對(duì)照，Anti HER2 ScFv與乳腺癌細(xì)胞SKBR3、BT474和MCF7細(xì)胞表面受體充分結(jié)合2 h，添加胎牛血清100 mL/L，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別經(jīng)過(guò)12、24、48 h混合孵育后，1×PBS洗3~5次。共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光在SKBR3、BT474和 MCF7細(xì)胞表面受體分布情況，判斷攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體對(duì)這兩種陽(yáng)性一種陰性的腫瘤細(xì)胞的鑒定能力及不同時(shí)間段的結(jié)合穩(wěn)定性。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，將所取得的原始抗體溶液倍比稀釋后，分別與一定濃度的經(jīng)過(guò)培養(yǎng)24 h HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞SKBR3培養(yǎng)液混合孵育，能觀察到綠色熒光的最大倍比稀釋倍數(shù)就是該抗體的滴度。

1.2.10 融合抗體Anti HER2 ScFv-GFP檢測(cè)病理組織結(jié)果與免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

取臨床9例標(biāo)本的石蠟切片放置在60 ℃恒溫箱中烘烤2 h，然后置于二甲苯中浸泡10 min，更換二甲苯再次浸泡 10 min，無(wú)水乙醇中浸泡5 min，95%乙醇浸泡5 min，70%乙醇浸泡5 min，PBS洗2次，每次5 min，蒸餾水沖洗5 min。在微波爐里加熱 0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)，沸騰后放入石蠟切片，斷電，間隔10 min，反復(fù)1~2次。蒸餾水洗5 min，PBS洗2次，各5 min，加3% H2O2孵育30 min (室溫)，PBS洗3次，各5 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，根據(jù)細(xì)胞水平上Anti HER2 ScFv-GFP融合蛋白結(jié)合細(xì)胞的濃度滴加蛋白樣品50 mL于切片上，置于4 ℃過(guò)夜，PBS洗3次，各5 min，封片，共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光分布情況，分析該融合抗體的工作滴度。用S-P 法免疫組化 (Immunohistochemistry，IHC) 檢測(cè)HER2蛋白的表達(dá)。在光鏡下觀察時(shí)，需注意細(xì)胞膜完全著色的腫瘤細(xì)胞比例及著色強(qiáng)度，HER2蛋白表現(xiàn)為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞膜。根據(jù)HER2蛋白表達(dá)的強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，高倍顯微鏡下觀察10個(gè)視野，沒(méi)有染色或小于30 %的腫瘤細(xì)胞染色為陰性，大于30%的腫瘤細(xì)胞有不完整細(xì)胞膜著色為弱陽(yáng)性 (+)，大于30%的腫瘤細(xì)胞有較弱但完整的細(xì)胞膜著色為陽(yáng)性(++)，大于30%的腫瘤細(xì)胞較強(qiáng)完整細(xì)胞膜著色為強(qiáng)陽(yáng)性 (+++)。

2 結(jié)果

2.1 融合基因Anti HER2 ScFv-GFP的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得Anti HER2 ScFv片段在800 bp左右，GFP為700 bp左右 (圖1B)，將兩條同時(shí)具有BamHⅠ粘性末端的膠回收片段產(chǎn)物直接連接 (圖1A)，以連接產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增獲得1 500 bp左右的融合基因 (圖1B)。融合基因克隆到 T載體后，測(cè)序表明整個(gè)融合基因?yàn)? 539 bp，Blast分析重組子中的融合基因序列與理論序列同源性為100%，表明融合基因構(gòu)建成功。

2.2 真核表達(dá)載體 pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP的構(gòu)建與重組Bacmid鑒定

雙酶切重組子 pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP，在1 500 bp有明顯條帶 (圖2A-1)，單酶切結(jié)果與理論序列長(zhǎng)度一致 (圖 2A-2)，經(jīng)測(cè)序結(jié)果完全正確，以M13通用引物進(jìn)行PCR鑒定陽(yáng)性Bacmid，結(jié)果在3 800 bp左右有明顯條帶(圖2B)，與預(yù)期相符合，融合基因Anti HER2 ScFv-GFP完全重組到Bacmid上。

圖1 融合基因Anti HER2 ScFv-GFP的構(gòu)建Fig. 1 Construction of the fusion gene Anti HER2 ScFv-GFP. (A) Schematic diagram of the fusion gene Anti HER2 ScFv-GFP. (B) M: marker; 1: PCR product of Anti HER2 ScFv; 2: PCR product of GFP; 3: PCR product of fusion gene Anti HER2 ScFv-GFP.

圖2 pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP的單、雙酶切鑒定與重組Bacmid的PCR鑒定Fig. 2 The restriction enzyme analysis of the recombinant pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP and the PCR production of positive recombinant bacmid. (A) M: marker; 1: the double digestion product of pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP positive plasmid; 2: the single digestion product of pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP positive plasmid. (B) M: marker; 1: the PCR product of the recombinant bacmid containg fusion gene Anti HER2 ScFv-GFP.

2.3 融合基因Anti HER2 ScFv-GFP在sf9中的表達(dá)與Western blotting鑒定分析

用Lipoefectin介導(dǎo)轉(zhuǎn)染粉紋夜蛾細(xì)胞sf9細(xì)胞。5 d后有少量綠色熒光顯示 (圖3A-b)，預(yù)示融合基因在sf9細(xì)胞成功表達(dá)。分離獲得血清中的重組病毒顆粒，連續(xù)3輪感染昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9，通過(guò)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白越來(lái)越多，均勻分布在靠近細(xì)胞膜附近(如圖3A-c)。細(xì)胞破碎后離心的上清液經(jīng)Ni2+-NTA親合層析純化后濃度測(cè)定為115.5 mg/L，純化蛋白樣品經(jīng) SDS-PAGE分離后結(jié)果表明是一條帶，Bandscan軟件計(jì)算純化的目的蛋白純度約97%，Western blotting結(jié)果表明有特異性條帶在60 kDa左右，與預(yù)期相符合 (圖3B)。

2.4 單克隆抗體Western blotting法檢測(cè)三種乳腺癌細(xì)胞株HER2表達(dá)狀態(tài)

三種乳腺癌細(xì)胞破碎物經(jīng)過(guò)Western blotting分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞株 SKBR3和 BT474在130~250 kDa之間有特異性條帶，與報(bào)道的HER2蛋白分子量約185 kDa相符合 (圖4)，表明細(xì)胞株SKBR3和BT474為HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞株，而 MCF7無(wú)特異性條帶出現(xiàn)，表明該細(xì)胞株為HER2陰性。

圖3 融合基因Anti HER2 ScFv-GFP在sf9中的表達(dá) (200×)Fig. 3 Expression and analysis of the fusion antibody Anti HER2 ScFv-GFP. (A) Expression of fusion protein Anti HER2 ScFv-GFP in insect cells sf9 (200×). A: negative control insect cells sf9 without transfected the recombinant bacmid; b: the result of sf9 cells transfected by the the recombinant bacmid; c: the result of sf9 cells infected by the the recombinant bacmid. (B) Western blotting analysis of the fusion protein Anti HER2 ScFv-GFP. M: marker; 1: the result of Western blotting.

2.5 融合抗體Anti HER2 ScFv-GFP檢測(cè)3種乳腺癌細(xì)胞株HER2表達(dá)狀態(tài)

激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn) 12 h后已認(rèn)定為HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞BT474、SKBR3表面有明顯的綠色熒光出現(xiàn)，并且不能被 PBS洗脫，而已認(rèn)定為HER2陰性的乳腺癌細(xì)胞MCF7經(jīng)過(guò)洗脫后細(xì)胞表面無(wú)綠色熒光存在 (圖5A)。GFP標(biāo)準(zhǔn)品陰性對(duì)照表明 GFP本身并沒(méi)有結(jié)合到細(xì)胞表面的能力 (圖5B)。

融合抗體與 3種乳腺癌細(xì)胞混合孵育 24 h后，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)已認(rèn)定為HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞 BT474、SKBR3表面仍然具有明顯的綠色熒光出現(xiàn)，并且不能被PBS洗脫，而已認(rèn)定為HER2陰性的乳腺癌細(xì)胞MCF7經(jīng)過(guò)洗脫后細(xì)胞表面仍然無(wú)綠色熒光存在 (圖6A)。 GFP標(biāo)準(zhǔn)品陰性對(duì)照表明 GFP本身并沒(méi)有結(jié)合到細(xì)胞表面的能力 (圖6B)。

圖4 Western blotting檢測(cè)3種乳腺癌細(xì)胞株HER2表達(dá)狀態(tài)Fig. 4 Western blotting analysis of the Anti HER2 antibody for HER2 positive cancer cells.

圖5 融合抗體在12 h后HER2的檢測(cè)結(jié)果 (200×)Fig. 5 Detection result of the fusion antibody testing HER2 after 12 h (200×).

融合抗體與 3種乳腺癌細(xì)胞混合孵育 48 h后，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)已認(rèn)定為HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞 BT474、SKBR3表面具有較弱的綠色熒光出現(xiàn)，也不能被PBS洗脫，而已認(rèn)定為HER2陰性的乳腺癌細(xì)胞MCF7經(jīng)過(guò)洗脫后細(xì)胞表面無(wú)綠色熒光存在 (圖7A)。GFP標(biāo)準(zhǔn)品陰性對(duì)照表明GFP本身并沒(méi)有結(jié)合到細(xì)胞表面的能力 (圖7B所示)。表明純化后的蛋白溶液在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱存放48 h仍然具有靶向檢測(cè)的能力。2倍稀釋法測(cè)定該純化的融合抗體滴度約為1∶64。

2.6 融合抗體Anti HER2 ScFv-GFP檢測(cè)病理組織結(jié)果與免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

9例乳腺癌標(biāo)本的同一組織分別用免疫組織化學(xué)法 (IHC) 和攜帶綠色熒光的融合抗體檢測(cè)臨床HER2的表達(dá)狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在激光共聚焦顯微鏡下觀察到IHC法檢測(cè)為CerbB-2(-)陰性的病理組織 3例，用融合抗體觀察不到綠色熒光(圖8A、B)，同理IHC法檢測(cè)為CerbB-2 (++) 的病理組織3例，用融合抗體檢測(cè)可以見(jiàn)到不是十分明顯的綠色存在 (圖8C、D)，而CerbB-2 (+++)的病理組織3例，用融合抗體檢測(cè)到明顯的綠色熒光存在 (圖8E、F)，與預(yù)計(jì)結(jié)果相符合。

圖6 融合抗體在24 h后HER2的檢測(cè)結(jié)果 (200×)Fig. 6 Detection result of the fusion antibody testing HER2 after 24 h (200×).

圖7 融合抗體在48 h后HER2的檢測(cè)結(jié)果 (200×)Fig. 7 Detection result of the fusion antibody testing HER2 after 48 h (200×).

圖8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)病理組織結(jié)果對(duì)比融合抗體Anti HER2 ScFv-GFP檢測(cè)病理組織結(jié)果 (100×)Fig. 8 Comparison of detection HER-2 in the same tumor samples using IHC and ScFv binding technique (100×).

3 討論

臨床上一般先通過(guò)檢測(cè)HER2是否為陽(yáng)性來(lái)判斷是否給病人施用單克隆抗體藥物[12-14]。因此，創(chuàng)建一種精確度高、誤差小且方便的檢測(cè)HER2的方法對(duì)臨床治療措施的確定具有借鑒意義。

目前，HER2檢測(cè)主要是分析人17號(hào)染色體上的癌基因HER2的擴(kuò)增水平或者腫瘤細(xì)胞表面HER2蛋白胞外區(qū)的分布量。免疫組化法 (IHC)通過(guò)一抗結(jié)合HER2蛋白胞外區(qū)后二抗結(jié)合一抗并激活底物反應(yīng)顯色來(lái)觀察細(xì)胞膜被染色的比例。臨床上將HER2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)為0、1+、2+、3+，其中2+和3+表示為陽(yáng)性結(jié)果。但是，HER22+和3+的結(jié)果中用FISH技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)無(wú)HER2基因擴(kuò)增的現(xiàn)象經(jīng)常出現(xiàn)[15-16]。研究表明，標(biāo)本的制備、正常組織上皮著色、細(xì)胞質(zhì)著色、染色記數(shù)誤差等因素導(dǎo)致 20%左右的IHC檢測(cè)結(jié)果不可靠[17-18]。FISH技術(shù)是通過(guò)熒光標(biāo)記的DNA探針與陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核內(nèi)雜交于DNA靶序列的多種彩色信號(hào)，以獲得多種基因的狀態(tài)信息。FISH技術(shù)中的DNA探針一般將HER2基因和 17號(hào)染色體著絲粒序列包括在內(nèi)構(gòu)建混合探針，提高精確度。熒光原位雜交法(FISH) 比免疫組化法 (IHC) 明顯精確度高[19]。但是，DNA探針的選擇、PCR擴(kuò)增過(guò)程的重復(fù)性、G2期細(xì)胞內(nèi)的基因拷貝數(shù)目特征可能導(dǎo)致的計(jì)數(shù)誤差也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果精確度下降。CISH技術(shù)使用地高辛標(biāo)記的探針在甲醛固定、石蠟包埋組織的切片上進(jìn)行雜交，然后用鼠抗地高辛抗體和辣根過(guò)氧化物酶-抗鼠抗體進(jìn)行免疫結(jié)合、DAB顯色，觀察雜交結(jié)果。但是，也存在著加熱時(shí)間、消化時(shí)間難以控制而造成誤差的可能。

抗HER2的單鏈抗體具有特異性靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面HER2受體的特點(diǎn)，綠色熒光蛋白可作為報(bào)告基因來(lái)研究基因的表達(dá)、細(xì)胞分化及蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)定位和轉(zhuǎn)運(yùn)等。

本研究在前期工作基礎(chǔ)上，利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)pFast Bac HT A/sf9表達(dá)獲得攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體，將該融合抗體應(yīng)用于已被認(rèn)定的 HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞BT474和SKBR3，12 h和24 h后的檢測(cè)結(jié)果表明同一濃度的不同時(shí)間觀察，均能看到 BT474和SKBR3表面有強(qiáng)烈的綠色熒光出現(xiàn)，與已認(rèn)定的結(jié)果相符合。而48 h后細(xì)胞表面綠色熒光變暗，推測(cè)為綠色熒光蛋白的自身弱化原因。張瑰紅等[20]在對(duì)比CISH和IHC對(duì)HER2檢測(cè)效果的研究中發(fā)現(xiàn)兩種方法檢測(cè)的結(jié)果符合率只有81.2%，而本研究中，兩種HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞均能被檢出，HER2陰性結(jié)果不能被檢出，符合率達(dá) 100%。國(guó)外關(guān)于乳腺癌的研究統(tǒng)計(jì) CISH和FISH的結(jié)果符合率在90%以上，但是仍然有誤差存在[21-24]，3種方法產(chǎn)生誤差的一個(gè)共同影響因素為染色。而利用攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體靶向結(jié)合 HER2陽(yáng)性的細(xì)胞表面檢測(cè)HER2的表達(dá)狀態(tài)，可避免這個(gè)環(huán)節(jié)的出現(xiàn)從而提高檢測(cè)的精確度。

此外，檢測(cè)結(jié)果在12 h或24 h左右即可獲得，使用普通熒光顯微鏡或者激光共聚焦顯微鏡即可觀測(cè)到檢測(cè)結(jié)果，不需要特殊圖象軟件或者多種抗體參與檢測(cè)過(guò)程，而其他3種方法均有特殊的要求[25]。

在臨床實(shí)驗(yàn)中，本研究用幾例臨床病理組織標(biāo)本對(duì)比檢測(cè)結(jié)果，HER2的存在以及表達(dá)量與綠色熒光的分布及強(qiáng)弱有一定的相關(guān)性，但是將攜帶綠色熒光的融合抗體大量應(yīng)用到臨床標(biāo)本是否具有此規(guī)律仍然未知，該融合抗體的結(jié)合特異性和親和能力也需要驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)采用的腫瘤細(xì)胞 BT474、SKBR3和MCF7均為已認(rèn)定HER2表達(dá)狀態(tài)，且為成熟細(xì)胞株，但是臨床上各種 HER2表達(dá)狀態(tài)的細(xì)胞類(lèi)型還有很多，臨床價(jià)值的探索還要進(jìn)一步深入研究。

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